Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Microbial Ecology Collaborative med finansiering fra NSF tildeling #EPS-1655726.

1. Laboratoriebænk og værktøjsforberedelse til læsning af en 96-brøndplade
<ol><li>Klar bordplade ved dugning med 70% ethanol. Tør og lad luften tørre før sprøjtning bænk top med 10% blegemiddel. Tør bordpladen tør.</li>
	<li>Steriliser mikro-scoopula, spatel og kirurgisk saks (buet) ved at dyppe i 95% ethanol og derefter udsætte for en flamme. Dyp hver i 10% blegemiddel og lad det lufttørre før brug. BEMÆRK: Værktøj skal steriliseres mellem hver prøve.</li>
</ol>2. Delprøve...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

Denne metode reducerer mulighederne for godt-til-brønd krydskontaminering, mens du lægger høj-throughput prøveudsugningsplader og giver en mere kontrolleret måde at indlæse 96-brønd plader ud over de eksisterende pladebelastningsstrategier9,10. Kontaminering blandt brønde kan være mere udbredt i 96-brøndpladeekstraktioner end i enkeltrørsekstraktioner, især når automatiseret6,7, og, men ikke ...

De seneste fremskridt inden for høj-gennemløb sekventering af mikrobielle samfund giver uovertruffen sekventering dybde og dermed en upræfærdig indblik i funktion og mangfoldighed af Jordens mikrobiom1. Efterhånden som evnen til at multiplex flere og flere prøver på en enkelt sekventering lane stiger, enkelt rør DNA-ekstraktion har potentiale til at blive en sats-begrænsende skridt i produktionen af økologiske data. Men nye metoder i høj-throughput DNA-ekstraktioner holde løfte om behandling af store mængder af miljøprøver med større effektivitet end tidligere har været muligt2. Disse metoder indebærer ofte brug af 96-brøndplader i stedet for enkeltrør, hvilket øger det mulige antal ekstraktioner, der kan forekomme samtidigt. Som sådan er det praktisk og effektivt af høj-throughput ekstraktionsmetoder er indlysende og er blevet gennemført til behandling af miljøprøver lige frajord 3,,4 og plantevæv3,5 til humant fækalmateriale2.
Mens disse metoder dramatisk kan fremskynde langs prøve forarbejdning og DNA-ekstraktion, det første trin i lastning jord og andre økologiske prøver i 96-brønd plader er modtagelige for cross-prøve forurening. Denne type brønd-til-brønd forurening kan forekomme underDNA-ekstraktioner 6,7,8, og brønde er særligt sårbare i dette første trin, før prøverne er suspenderet i en buffer løsning. McPherson et al.9 demonstrere en metode til at indlæse rhizosfærejord i 96-brønd plader ved hjælp af tragte og 8-godt PCR stripdæksler, men mens deres metode er en mere kontrolleret tilgang til lastning plader, det stadig giver rig mulighed for forurening af tilstødende brønde, når lastning hver prøve. Derudover giver de åbne brønde mulighed for en distraheret forsker til at placere en prøve i den forkerte brønd eller tilføje en prøve i en brønd, der allerede er blevet indlæst. Desuden viser en række forskellige stikprøvetyper sig at være dårligt egnede til lastning med denne metode. våde prøver ofte holde sig til tragte og tørre prøver 'hoppe' mellem brønde på grund af statisk elektricitet.
For at reducere mulighederne for forurening blandt brønde i det første trin af høj-throughput DNA-ekstraktioner, udviklede vi en ny tilgang til lastning jordprøver i 96-brønd plader. Vores metoder både beskytte brønde fra miljøeksponering og forhindre os i ved et uheld at indlæse flere prøver i en brønd (dobbelt-loading). Vi mener, at den metode, der rapporteres nedenfor, giver løfte om at reducere risikoen for forurening og som sådan giver et mere kontrolleret middel til at indlæse 96-brøndsplader til efterfølgende DNA-ekstraktion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

Høj-throughput DNA sekventering teknikker har bidraget væsentligt til fremskridt i vores forståelse af relationer mellem mikrobielle samfund, vært egenskaber, og bredere økosystem funktioner. Med denne hurtige stigning i bredden og dybden af sekventering kapaciteter er kommet metoder til at udtrække, forstærke, analysere og fortolke miljømæssige DNA med succes med maksimal effektivitet. Desværre kan udførelse af DNA-ekstraktioner hurtigt komme på bekostning af at øge risikoen for forurening blandt prøver. Især høj-throughput ekstraktioner, der er baseret på prøver indeholdt i en 96-brønd plade tilbyder en forholdsvis hurtig metode, sammenlignet med enkelt-rør ekstraktioner, men også øge mulighederne for godt-til-godt krydskontaminering. For at minimere risikoen for krydskontaminering blandt prøver, samtidig med at fordelene ved høj-throughput ekstraktion teknikker, vi udviklet en ny metode til lastning miljøprøver i 96-brønd plader. Vi brugte gennemborelige PCR forsegling film til at dække hver plade, mens lastning prøver og tilføjede prøver først til PCR rør, før du flytter dem ind i brønde; denne praksis reducerer risikoen for prøvedrift og utilsigtet dobbeltbelastning af brønde. Den metode, der er skitseret i dette papir giver forskerne en tilgang til at maksimere tilgængelige high-throughput udvinding teknikker og samtidig reducere risikoen for krydskontaminering iboende til 96-brønd plader. Vi giver en detaljeret trin for trin skitse af, hvordan man flytter fra prøveindsamling til DNA-ekstraktion og samtidig minimerer risikoen for uønsket krydskontaminering.

Denne nye metode blev anvendt med succes til at indlæse 96-brønd DNA ekstraktionsplader. Sammenligning af pladebelastningsmetoder viste, at vores metode til at have den laveste DNA-koncentration i de tomme brønde. DNA-koncentrationen i de tomme brønde var betydeligt lavere end den foreslåede metode min McPherson et al.9 (p < 0,05), selv om DNA-koncentrationer i vores metode ikke var statistisk forskellige fra Qiagen standardmetode (Figur 2). Alle tre metoder prod...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Nuværende metoder til lastning 96-brønd plader til DNA-ekstraktioner kan være tilbøjelige til forurening. Vi beskriver en ny metode til lastning af 96-brøndplader, der reducerer risikoen for krydskontaminering blandt brønde. Vores metode vil hjælpe andre forskere udnytte effektiviteten af høj-throughput DNA-ekstraktion teknikker og minimere risikoen for forurening.

Modificerede metoder til belastning af høj-throughput DNA ekstraktionsplader reducere risikoen for forurening

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Denne protokol giver en teknik til at øge effektiviteten af 96-brønd DNA ekstraktionsplade belastning og samtidig mindske risikoen for prøve krydskontaminering. Denne teknik reducerer chancerne for forurening under det kritiske første trin af DNA-ekstraktion gennem individuel tilsætning af prøver til hver brønd i 96-brøndpladen. Denne metode kan anvendes på nogen af de forskellige områder af mikrobiom forskning.Før du begynder et eksperiment, tåge bænken toppen med 70% ethanol. Efter aftørring, lad bænken lufttørre før sprøjtning bænken med 10% blegemiddel. Efter aftørring og lufttørring, dyppe mikroskopiske, spatular, og buede kirurgiske saks i 95% ethanol og udsætte værktøjerne til en flamme.Derefter dyppe hvert værktøj i 10% blegemiddel og lad værktøjerne til lufttørre. Før underprøvetagning steriliseres handskerne og homogeniseres jordprøverne grundigt. Næste tildele en prøve ID med godt placering til hvert rør.95 millilitercentrifugerør fyldes med 95 millilitercentrifugeglas med én prøve pr. rør, indtil hvert rør er ca. halvt fyldt. 96. rør skal anvendes som ekstraktionsdyr. Anlæste subprøverørene på is, og mærg 96 sterile 200 mikroliter flat-caped PCR-rør i henhold til brøndetiketterne til en 96-brøndplade, og anlæt derefter etiketten 200 mikroliterrør i orden i et 96-brøndstativ.For at forberede en 96-brønd plade til forsøget, skal du fjerne dækslet fra pladen og placere dækslet i en steril plastikpose. Forsegl posen for at forhindre kontaminering og dæk pladen med et forskåret stykke gennemboreligt tætningsfilm. Brug derefter en gummirulle til at holde tætningen fast på pladen og opbevare pladen ved fire grader Celsius.For at overføre underprøverne til pladen anbringes 24 af de to milliliter-delprøverør i en isblok til koldopbevaring, og prøvenavnet og brøndens placeringsark anvendes til at udvælge de relevante 200 mikroliter fladklædte rør. Vortex underprøverne én ad gangen i fem sekunder pr. prøve for at sikre homogenisering og belastning af ca. 200 mikroliter af hver prøve i det relevante tilsvarende PCR-rør. Når alle 24 prøver er blevet indlæst, skal du bruge en bleget gennemblødt papirservietter til at rengøre ydersiden af et PCR-rør og vende og banke røret på bænken for at flytte prøven til toppen af røret.Brug af flammen steriliseret og bleget saks klip bunden af PCR rør til at skabe en åbning for prøven, og passere røret over pladen med den afskårne ende vender op, indtil den relevante godt er nået. Vip pladen en smule for at lette punktering af den forskårne gennemborelige tætningsfilm og med røret direkte over den korrekte brønd, og inverter forsigtigt pladen, så den afskårne spids passer ind i brønden. Brug et steriliseret værktøj til at trykke på toppen af røret, indtil al jorden er faldet fra røret ind i brønden.Og lad røret i brønden med føringen lukket. Når alle prøverne er blevet lastet på samme måde, fjernes et 200 mikroliter flat-capped PCR-rør og tilsættes 750 mikroliter perleopløsning til prøveblyten. Placer den 200 mikroliter flad-capped PCR rør tilbage i brønden skubbe det hele vejen ned i brønden.Og brug en Sharpie til at markere toppen af røret for at angive brønden er blevet indlæst. Når alle brøndene er blevet læsset med perler returnere de 24 prøverør til 20 grader Celsius opbevaring og tilføje 24 nye sub-prøve rør til isblokken, for at tillade det næste sæt af prøver, der skal indlæses i 96-godt plade som netop påvist. Når alle 95 af brøndene er blevet læsset med prøve og perle opløsning, tilføje perle løsning kun til 96th godt.Fjern alle rørene, passerer dem over dækket brønde kun og forsigtigt fjerne gennemborelige film fra pladen. Derefter forsigtigt overføre pladedækslet fra plastposen til pladen og placere pladen ved 20 grader Celsius indtil den planlagte udvinding. En sammenligning af pladebelastningsmetoder viser, at den demonstrerede metode resulterer i den laveste DNA-koncentration i de tomme brønde.Ved hjælp af denne metode var DNA-koncentrationen betydeligt lavere end ved anvendelse af den metode, der blev foreslået af McPherson et al. Selv om DNA-koncentrationen ved denne metode ikke var statistisk anderledes end qiagen-standardmetoden. Alle tre metoder, producere gennemsnitlige DNA koncentrationer under to nanogram per microliter.Selv om kun denne nye metode producerer brønde uden målbar DNA-koncentration. For at minimere risikoen for spild skal du holde 200 mikroliterrøret oprejst, når du flytter det hen over pladen, vippes pladen og sættes i den korrekte brønd.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: En metode til Voksende Arabidopsis Og tomatplanter i 96-brønds plader for High-Throughput genotypebestemmes

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generering af høj kvalitet Chromatin Immunoprecipitation DNA Skabelon til High-throughput sekventering (Chip-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Inddrivelse af voksne zebrafisk Hearts for high-throughput applikationer

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening for kemiske modulatorer af post-transkriptionelt regulerede gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion og karakterisering af DNA Ændringer af Generation of Tomato Behårede Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Metoder til ekstraktion af endosymbionter fra Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Standardiseret metode til høj overførselshastighed Sterilisation af Arabidopsis frø

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Parallel høj gennemløb enkelt molekyle kinetisk analyse for site-specifikke DNA spaltning

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Høj-gennemløb metabolisk profilering for model raffinementer af mikroalger

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...