Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door de Microbiële Ecologie Collaborative met financiering van NSF award #EPS-1655726.

1. Laboratoriumbank en gereedschapsvoorbereiding voor het laden van een 96-putplaat
<ol><li>Heldere banktop door nevelen met 70% ethanol. Veeg af en laat de lucht drogen voordat u de bank met 10% bleekwater besproeit. Veeg de bank boven droog.</li>
	<li>Steriliseren micro-scoopula, spatel, en chirurgische schaar (gebogen) door dompelen in 95% ethanol en vervolgens bloot te stellen aan een vlam. Dip elk in 10% bleekmiddel en laat de lucht drogen voorafgaand aan gebruik. OPMERKING: Hulpmiddelen moeten tussen elk monst...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

Deze methode vermindert de mogelijkheden voor goed tot goed kruisbesmetting tijdens het laden van monsterextractieplaten met hoge doorvoer en biedt een meer gecontroleerd middel om platen met 96-bron te laden die verder gaan dan de bestaande strategieën voor het laden van platen9,10. Verontreiniging tussen putten kan meer alomtegenwoordig zijn bij 96-put plaatextracties dan bij extracties met één buis, vooral wanneer geautomatiseerde6<s...

Recente vooruitgang in high-throughput sequencing van microbiële gemeenschappen bieden ongeëvenaarde sequencing diepte en, bijgevolg, een onvoorwaardelijke blik in de werking en diversiteit van het microbioom van de aarde1. Naarmate de mogelijkheid om multiplex meer en meer monsters op een enkele sequencing lane toeneemt, single tube DNA extractie heeft het potentieel om een tarief-beperkende stap in de generatie van ecologische gegevens. Nieuwe methoden bij dna-extracties met hoge doorvoer beloven echter grote hoeveelheden milieumonsters met een grotere efficiëntie dan voorheen mogelijk was2. Deze methoden omvatten vaak het gebruik van 96-well platen in plaats van single-tubes, waardoor het mogelijke aantal extracties die gelijktijdig kunnen optreden. Als zodanig zijn de uitvoerbaarheid en efficiëntie van extractiemethoden met hoge doorvoer duidelijk en zijn zij toegepast voor de verwerking van milieumonsters, variërend van bodem3,4 en plantaardige weefsels3,5 tot menselijke fecale stoffen2.
Hoewel deze methoden drastisch kunnen versnellen langs monsterverwerking en DNA-extractie, is de eerste stap van het laden van grond en andere ecologische monsters in 96-put platen gevoelig voor kruismonsterverontreiniging. Dit type van goed-tot-welzijn besmetting kan optreden tijdens DNA-extracties6,7,8, en putten zijn bijzonder kwetsbaar in deze eerste stap voordat monsters worden opgehangen in een bufferoplossing. McPherson et al.9 tonen een methode om rhizosfeerbodems in 96-putplaten te laden met behulp van trechters en 8-well PCR-striphoezen, maar terwijl hun methode een meer gecontroleerde benadering van laadplaten is, biedt het nog steeds voldoende gelegenheid voor verontreiniging van naburige putten bij het laden van elk monster. Bovendien bieden de open putten de kans voor een afgeleide onderzoeker om een monster in de onjuiste put te plaatsen of een monster toe te voegen in een put die al is geladen. Bovendien blijken verschillende monstersoorten niet geschikt te zijn om met deze methode te worden geladen; natte monsters vaak vasthouden aan de trechters en droge monsters 'springen' tussen putten als gevolg van statische elektriciteit.
Om de kans op verontreiniging tussen putten te verminderen in de eerste stap van dna-extracties met hoge doorvoer, ontwikkelden we een nieuwe aanpak voor het laden van bodemmonsters in 96-putplaten. Onze methoden beschermen putten tegen blootstelling aan het milieu en voorkomen dat we per ongeluk meerdere monsters in één put laden (dubbelladen). Wij geloven dat de onderstaande methode belooft het potentieel voor verontreiniging te verminderen en als zodanig een meer gecontroleerde manier biedt om 96-well platen te laden voor latere DNA-extractie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

Dna-sequencingtechnieken met hoge doorvoer hebben aanzienlijk bijgedragen aan de vooruitgang in ons begrip van relaties tussen microbiële gemeenschappen, gastheerkenmerken en bredere ecosysteemfuncties. Met deze snelle toename van de breedte en diepte van de sequencing mogelijkheden zijn gekomen methoden om te extraheren, versterken, analyseren en interpreteren milieu-DNA met succes met maximale efficiëntie. Helaas kan het uitvoeren van DNA-extracties snel ten koste gaan van het verhogen van het risico op besmetting tussen monsters. Met name extracties met hoge doorvoer die gebaseerd zijn op monsters in een 96-putplaat bieden een relatief snelle methode, in vergelijking met extracties met één buis, maar vergroten ook de mogelijkheden voor goed tot goed kruisbesmetting. Om het risico van kruisbesmetting tussen monsters te minimaliseren, met behoud van de voordelen van technieken voor het afzuiden van hoge doorvoer, hebben we een nieuwe methode ontwikkeld voor het laden van milieumonsters in 96-putplaten. We gebruikten pierceable PCR afdichtingsfolies om elke plaat te bedekken tijdens het laden van monsters en voegden eerst monsters toe aan PCR-buizen voordat we ze in putten verplaatsten; samen verminderen deze praktijken het risico op monsterdrift en onbedoelde dubbele belasting van putten. De methode die in dit document wordt beschreven, biedt onderzoekers een aanpak om de beschikbare technieken voor het uitstipperen van hoge doorvoerextractie te maximaliseren en tegelijkertijd het risico op kruisbesmetting te verminderen dat inherent is aan 96-putplaten. We geven een gedetailleerd stap voor stap overzicht van hoe je van monsterverzameling naar DNA-extractie gaan en tegelijkertijd het risico op ongewenste kruisbesmetting minimaliseert.

Deze nieuwe methode werd met succes gebruikt om 96-well DNA extractieplaten te laden. Vergelijking van plaatbeladingsmethoden toonde onze methode om de laagste DNA-concentratie in de lege putten te hebben. De DNA-concentratie in de lege putten was aanzienlijk lager dan de voorgestelde methode mijn McPherson et al.9 (p < 0,05), hoewel dna-concentraties in onze methode statistisch niet verschilden van de Qiagen standaardmethode(figuur 2). Alle drie de geproduceerde meth...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Huidige methoden voor het laden van 96-well platen voor DNA-extracties kunnen gevoelig zijn voor verontreiniging. We beschrijven een nieuwe methode voor het laden van 96-well platen die het risico op kruisbesmetting tussen putten vermindert. Onze methode zal andere onderzoekers helpen om te profiteren van de efficiëntie van dna-extractietechnieken met hoge doorvoer en het risico op besmetting te minimaliseren.

Gewijzigde methoden voor het laden van DNA-extractieplaten met hoge doorvoer verminderen het potentieel voor verontreiniging

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Dit protocol biedt een techniek voor het verhogen van de efficiëntie van 96-well DNA-extractieplaat laden, terwijl tegelijkertijd het verminderen van het risico van kruisbesmetting van monsters. Deze techniek vermindert de kans op besmetting tijdens de kritische eerste stap van DNA-extractie door de individuele toevoeging van monsters aan elke put in de 96-put plaat. Deze methodologie kan worden toegepast op een van de verschillende gebieden van microbioom onderzoek.Voor het begin van een experiment, mist de bank top met 70%ethanol. Laat na het afvegen de bank drogen voordat u de bank besproeit met 10% bleekmiddel. Na het afvegen en het drogen van de lucht, dip de microscopaire, spuugt, en gebogen chirurgische schaar in 95%ethanol en stel de instrumenten bloot aan een vlam.Dip vervolgens elk gereedschap in 10% bleekmiddel en laat de gereedschappen drogen. Voorafgaand aan de onderbemonstering steriliseert ethanol handschoenen en homogeniseert de bodemmonsters grondig. Vervolgens een voorbeeld-ID met putlocatie toewijzen aan elke buis.Vul 95 gelabelde twee milliliter centrifugebuizen met één monster per buis, totdat elke buis ongeveer halfvol is. De 96e buis moet worden gebruikt als een extractie leeg. Plaats de sub-sample buizen op ijs, en label 96 steriele 200 microliter flat-caped PCR buizen volgens de put labels voor een 96-well plaat, plaats dan het etiket 200 microliter buizen in volgorde in een 96-well rack.Om een 96-put plaat voor te bereiden voor het experiment, verwijder de cover van de plaat en plaats het deksel in een steriele plastic zak. Verzegel de zak om besmetting te voorkomen en bedek de plaat met een voorgesneden stuk doorborenbare afdichtingsfolie. Gebruik vervolgens een rubberen roller om de afdichting stevig aan de plaat te hechten en de plaat op vier graden Celsius op te slaan.Om de submonsters op de plaat over te brengen, plaatst u 24 van de twee milliliter submonsterbuizen in een ijsblok voor koudeopslag en gebruikt u de monsternaam en het putlocatieblad om de overeenkomstige 200 met microliter plat afgetopte buizen te selecteren. Vortex de submonsters een voor een, gedurende vijf seconden per monster om homogenisatie te garanderen en ongeveer 200 microliter van elk monster te laden in de juiste overeenkomstige PCR buis. Wanneer alle 24 monsters zijn geladen, gebruik maken van een gebleekte geweekte papier doek om de buitenkant van een PCR-buis schoon te maken, en omkeren en tik op de buis op de bank om het monster te verplaatsen naar de bovenkant van de buis.Met behulp van de vlam gesteriliseerd en gebleekt schaar clip de onderkant van de PCR buis om een opening voor het monster te creëren, en geef de buis over de plaat met de cut-end naar boven totdat de juiste put is bereikt. Kantel de plaat iets, om het doorboren van de voorgesneden pierceable afdichtingsfilm te vergemakkelijken, en met de buis direct boven de juiste put, snel maar voorzichtig de plaat omkeren, zodat de snijpunt in de put past. Gebruik een gesteriliseerd gereedschap om de bovenkant van de buis te tikken totdat alle grond uit de buis in de put is gevallen.En laat de buis in de put met het lood dicht. Wanneer alle monsters op dezelfde manier zijn geladen, verwijdert u een 200 microliter plat afgetopte PCR-buis en voegt u 750 microliter kraaloplossing toe aan het monster. Plaats de 200 microliter flat-capped PCR buis terug in de put duwen het helemaal naar beneden in de put.En gebruik een Sharpie om de bovenkant van de buis te markeren om aan te geven dat de put is geladen. Wanneer alle putten zijn geladen met kralen terug de 24 monster buizen tot 20 graden Celsius opslag en voeg 24 nieuwe sub-monster buizen aan het ijsblok, zodat de volgende set monsters worden geladen in de 96-put plaat zoals net aangetoond. Wanneer alle 95 putten zijn geladen met monster en kraal oplossing, voeg kraal oplossing alleen aan de 96e put.Verwijder alle buizen, passeren ze over overdekte putten alleen en zorgvuldig verwijderen van de doorborenbare film van de plaat. Breng vervolgens voorzichtig het plaatdeksel van de plastic zak op de plaat en plaats de plaat op 20 graden Celsius tot de geplande extractie. Een vergelijking van plaatbeladingsmethoden toont aan dat de aangetoonde methode resulteert in de laagste DNA-concentratie binnen de lege putten.Met behulp van deze methode, de DNA-concentratie was aanzienlijk lager dan bij het gebruik van de methode voorgesteld door McPherson et al. Hoewel de DNA-concentratie met deze methode statistisch niet anders was dan de standaardmethode qiagen. Alle drie de methoden, produceren gemiddelde DNA-concentraties onder twee nanogram per microliter.Hoewel alleen deze nieuwe methode produceert putten zonder meetbare DNA-concentratie. Om de kans op morsen te minimaliseren, houdt u de 200 microliterbuis rechtop wanneer u deze over de plaat beweegt, kantelt u de plaat en plaatst u de buis in de juiste put.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

High-throughput versuikering test voor Lignocellulose Materialen

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: Een methode voor het kweken Arabidopsis En tomatenplanten in 96-well platen voor high-throughput genotypering

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Herstel van de Adult zebravis Harten voor High-throughput Toepassingen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methoden voor de extractie van endosymbionten uit de Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Gestandaardiseerde methode voor High-throughput sterilisatie van Arabidopsis zaden

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay voor site-specifieke DNA Decolleté

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

High-Throughput Metabole Profilering voor Modelverfijningen van Microalgen

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...