Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
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Cette recherche a été soutenue par la Microbial Ecology Collaborative avec un financement du prix NSF #EPS-1655726.

1. Banc de laboratoire et préparation d’outils pour le chargement d’une plaque de 96 puits
<ol><li>Haut de banc clair en confondant avec 70% d’éthanol. Essuyez et laissez sécher l’air avant de pulvériser le dessus du banc avec 10% d’eau de Javel. Essuyez le dessus du banc à sec.</li>
	<li>Stériliser la micro-scoopule, la spatule et les ciseaux chirurgicaux (courbés) en trempant dans 95% d’éthanol, puis exposer à une flamme. Tremper chacun dans 10% d’eau de Javel et laisser sécher à l’air avan...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

Cette méthode réduit les possibilités de contamination croisée bien à bien tout en chargeant des plaques d’extraction d’échantillons à haut débit et offre un moyen plus contrôlé de charger des plaques de 96 puits au-delà des stratégies existantes de chargement des plaques9,10. La contamination entre les puits peut être plus répandue dans les extractions de plaques de 96 puits que dans les extractions à un seul tube, en particulier lorsqu’elle...

Les progrès récents dans le séquençage à haut débit des communautés microbiennes fournissent une profondeur de séquençage inégalée et, par conséquent, un aperçu sans précédent du fonctionnement et de la diversité du microbiome de la Terre1. À mesure que la capacité de multiplex sur une seule voie de séquençage augmente, l’extraction de l’ADN à tube unique pourrait devenir une étape limitant les taux dans la production de données écologiques. Toutefois, les nouvelles méthodes d’extraction d’ADN à haut débit sont prometteuses pour le traitement de grandes quantités d’échantillons environnementaux avec une plus grande efficacité qu’auparavant2. Ces méthodes impliquent souvent l’utilisation de plaques de 96 puits au lieu de tubes simples, augmentant ainsi le nombre possible d’extractions qui peuvent se produire simultanément. En tant que tel, l’aspect pratique et l’efficacité des méthodes d’extraction à haut débit sont évidents et ont été mis en œuvre pour le traitement d’échantillons environnementaux allant du sol3,4 et les tissus végétaux3,5 à la matière fécale humaine2.
Bien que ces méthodes puissent accélérer considérablement le traitement des échantillons et l’extraction de l’ADN, la première étape du chargement du sol et d’autres échantillons écologiques dans des plaques de 96 puits est susceptible de contamination par des échantillons croisés. Ce type de contamination bien-à-puits peut se produire pendant les extractions d’ADN6,,7,8 , et les puits sontparticulièrementvulnérables dans cette première étape avant que les échantillons soient suspendus dans une solution tampon. McPherson et coll.9 démontrent une méthode pour charger les sols rhizosphères en plaques de 96 puits à l’aide d’entonnoirs et de couvertures de bandes DE PCR de 8 puits, mais bien que leur méthode soit une approche plus contrôlée des plaques de chargement, elle offre encore amplement d’occasions de contamination des puits voisins lors du chargement de chaque échantillon. De plus, les puits ouverts permettent à un chercheur distrait de placer un échantillon dans le puits incorrect ou d’ajouter un échantillon dans un puits qui a déjà été chargé. En outre, une variété de types d’échantillons s’avèrent mal adaptés au chargement avec cette méthode; les échantillons humides collent souvent aux entonnoirs et les échantillons secs « sautent » entre les puits en raison de l’électricité statique.
Afin de réduire les possibilités de contamination entre les puits dans la première étape des extractions d’ADN à haut débit, nous avons développé une nouvelle approche pour charger les échantillons de sol dans des plaques de 96 puits. Nos méthodes protègent les puits contre l’exposition à l’environnement et nous empêchent de charger accidentellement plusieurs échantillons dans un puits (double chargement). Nous croyons que la méthode rapportée ci-dessous offre la promesse de réduire le potentiel de contamination et en tant que telle fournit un moyen plus contrôlé de charger des plaques de 96 puits pour l’extraction ultérieure d’ADN.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

Les techniques de séquençage de l’ADN à haut débit ont grandement contribué aux progrès de notre compréhension des relations entre les communautés microbiennes, des caractéristiques de l’hôte et des fonctions plus larges de l’écosystème. Avec cette augmentation rapide de l’ampleur et de la profondeur des capacités de séquençage sont venus des méthodes pour extraire, amplifier, analyser et interpréter l’ADN environnemental avec succès avec une efficacité maximale. Malheureusement, l’extraction rapide de l’ADN peut se faire au prix d’augmenter le risque de contamination entre les échantillons. En particulier, les extractions à haut débit qui sont basées sur des échantillons contenus dans une plaque de 96 puits offrent une méthode relativement rapide, par rapport aux extractions à tube unique, mais augmentent également les possibilités de contamination croisée bien-à-bien. Afin de minimiser le risque de contamination croisée entre les échantillons, tout en conservant les avantages des techniques d’extraction à haut débit, nous avons mis au point une nouvelle méthode de chargement d’échantillons environnementaux dans des plaques de 96 puits. Nous avons utilisé des films d’étanchéité PCR perçables pour couvrir chaque plaque pendant le chargement des échantillons et ajouté des échantillons d’abord aux tubes PCR avant de les déplacer dans des puits; ensemble, ces pratiques réduisent le risque de dérive des échantillons et de double chargement involontaire des puits. La méthode décrite dans le présent document fournit aux chercheurs une approche pour maximiser les techniques d’extraction à haut débit disponibles tout en réduisant le risque de contamination croisée inhérent aux plaques de 96 puits. Nous fournissons un aperçu détaillé étape par étape de la façon de passer de la collecte d’échantillons à l’extraction de l’ADN tout en minimisant le risque de contamination croisée non désirée.

Cette nouvelle méthode a été utilisée avec succès pour charger des plaques d’extraction d’ADN de 96 puits. La comparaison des méthodes de chargement des plaques a montré que notre méthode avait la plus faible concentration d’ADN dans les puits vides. La concentration d’ADN dans les puits vierges était significativement inférieure à la méthode proposée par McPherson et coll.9 (p < 0,05), bien que les concentrations d’ADN dans notre méthode n’aient pas été statistiquement...

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Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Les méthodes actuelles de chargement des plaques de 96 puits pour les extractions d’ADN peuvent être sujettes à la contamination. Nous détaillons une nouvelle méthode de chargement des plaques de 96 puits qui réduit le risque de contamination croisée entre les puits. Notre méthode aidera d’autres chercheurs à tirer parti de l’efficacité des techniques d’extraction de l’ADN à haut débit et à minimiser les risques de contamination.

Méthodes modifiées pour le chargement des plaques d’extraction d’ADN à haut débit réduisent le risque de contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Ce protocole fournit une technique pour augmenter l’efficacité du chargement des plaques d’extraction d’ADN de 96 puits tout en réduisant le risque de contamination croisée de l’échantillon. Cette technique réduit les risques de contamination au cours de la première étape critique de l’extraction de l’ADN par l’ajout individuel d’échantillons à chaque puits dans la plaque de 96 puits. Cette méthodologie peut être appliquée à l’un des divers domaines de la recherche sur le microbiome.Avant de commencer une expérience, vaporiser le dessus du banc avec 70% d’éthanol. Après essuyage, laisser sécher l’air du banc avant de pulvériser le banc avec 10% d’eau de Javel. Après essuyage et séchage à l’air, trempez les ciseaux chirurgicaux microscopiaires, spatulaires et incurvés en 95 % d’éthanol et exposez les outils à une flamme.Puis trempez chaque outil dans 10% d’eau de Javel et laissez les outils sécher à l’air libre. Avant le sous-échantillonnage, l’éthanol stérilise les gants et homogénéise soigneusement les échantillons de sol. Ensuite, attribuez un iD d’échantillon avec l’emplacement du puits à chaque tube.Remplissez 95 tubes de centrifugeuse de deux millilitres étiquetés d’un échantillon par tube, jusqu’à ce que chaque tube soit à moitié plein. Le 96e tube doit être utilisé comme blanc d’extraction. Placez les tubes sous-échantillon sur la glace et étiquetez 96 tubes PCR à capuchon plat stériles de 200 microlitres selon les étiquettes du puits pour une plaque de 96 puits, puis placez l’étiquette 200 tubes de microlitre dans l’ordre dans une grille de 96 puits.Pour préparer une plaque de 96 puits pour l’expérience, retirez le couvercle de la plaque et placez le couvercle dans un sac en plastique stérile. Sceller le sac pour éviter la contamination et couvrir la plaque d’un morceau pré-coupé de film d’étanchéité perçable. Ensuite, utilisez un rouleau de caoutchouc pour coller fermement le joint à la plaque et stocker la plaque à quatre degrés Celsius.Pour transférer les sous-échantillons à la plaque, placez 24 des deux tubes sous-échantillon millilitres dans un bloc de glace pour l’entreposage frigorifique, et utilisez le nom de l’échantillon et la feuille de localisation du puits pour sélectionner les tubes à cap plat de 200 microlitres appropriés. Vortex les sous-échantillons un à la fois, pendant cinq secondes par échantillon pour assurer l’homogénéisation et charger environ 200 microlitres de chaque échantillon dans le tube PCR correspondant approprié. Lorsque les 24 échantillons ont été chargés, utilisez un lingette en papier trempé blanchi pour nettoyer l’extérieur d’un tube PCR, et inversez et appuyez sur le tube sur le banc pour déplacer l’échantillon vers le haut du tube.À l’aide de la flamme stérilisée et blanchie ciseaux clip le fond du tube PCR pour créer une ouverture pour l’échantillon, et passer le tube sur la plaque avec l’extrémité coupée face vers le haut jusqu’à ce que le puits approprié a été atteint. Inclinez légèrement la plaque, pour faciliter la ponctuation du film d’étanchéité perçable pré-coupé, et avec le tube directement au-dessus du puits correct, rapidement mais soigneusement inverser la plaque de sorte que la pointe de coupe s’insère dans le puits. Utilisez un outil stérilisé pour appuyez sur le dessus du tube jusqu’à ce que tout le sol soit tombé du tube dans le puits.Et laissez le tube dans le puits avec le plomb fermé. Lorsque tous les échantillons ont été chargés de la même manière, retirez un tube PCR à cap plat de 200 microlitres et ajoutez 750 microlitres de solution perlée au puits de l’échantillon. Placez le tube PCR à cap plat de 200 microlitres dans le puits en le poussant jusqu’au puits.Et utilisez un Sharpie pour marquer le haut du tube pour indiquer que le puits a été chargé. Lorsque tous les puits ont été chargés de perles, retournez les 24 tubes de l’échantillon à un stockage de 20 degrés Celsius et ajoutez 24 nouveaux tubes de sous-échantillon au bloc de glace, afin de permettre à la prochaine série d’échantillons d’être chargés dans la plaque de 96 puits comme nous venons de le démontrer. Lorsque les 95 puits ont été chargés avec l’échantillon et la solution de perle, ajoutez la solution de perle seulement au 96ème puits.Retirez tous les tubes, en les passant sur les puits couverts seulement et retirez soigneusement le film perçable de la plaque. Ensuite, transférez soigneusement le couvercle de la plaque du sac en plastique à la plaque et placez la plaque à 20 degrés Celsius jusqu’à l’extraction prévue. Une comparaison des méthodes de chargement des plaques montre que la méthode démontrée entraîne la plus faible concentration d’ADN dans les puits vierges.À l’aide de cette méthode, la concentration d’ADN était significativement plus faible que lors de l’utilisation de la méthode proposée par McPherson et coll. Bien que la concentration d’ADN par cette méthode n’étaient pas statistiquement différentes de la méthode par défaut qiagen. Les trois méthodes produisent des concentrations moyennes d’ADN sous deux nanogrammes par microlitre.Bien que seule cette nouvelle méthode produise des puits sans concentration mesurable d’ADN. Pour minimiser le risque de déversement, maintenez le tube de 200 microlitres droit lorsque vous le déplacez sur la plaque, inclinez la plaque et insérez le tube dans le puits correct.

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