Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
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Diese Forschung wurde vom Microbial Ecology Collaborative mit Einer Förderung des NSF-Preises #EPS-1655726 unterstützt.

1. Laborbank und Werkzeugvorbereitung zum Beladen einer 96-Well-Platte
<ol><li>Klare Bankspitze durch Vernebelung mit 70% Ethanol. Wischen und lassen Sie die Luft trocknen, bevor Sie die Bank mit 10% Bleichmittel besprühen. Wischen Sie die Bank oben trocken.</li>
	<li>Sterilisieren Sie Mikro-Scoopula, Spachtel und chirurgische Schere (gekrümmt) durch Eintauchen in 95% Ethanol und setzen Sie dann einer Flamme aus. Tauchen Sie jeweils in 10% Bleichmittel und lassen Sie die Luft vor der Verwendung trocknen. HINWEIS: ...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

Diese Methode reduziert die Möglichkeiten für eine gut zu-gut-kreuz-Kontamination beim Laden von Probenextraktionsplatten mit hohem Durchsatz und bietet eine kontrolliertere Möglichkeit, 96-Well-Platten über bestehende Plattenbelastungsstrategien9,10hinaus zu laden. Die Kontamination unter Brunnen kann bei 96-Well-Plattenextraktionen stärker ausgeprägt sein als bei Einrohrextraktionen, insbesondere bei automatisierten6,,<s...

Die jüngsten Fortschritte bei der Hochdurchsatzsequenzierung mikrobieller Gemeinschaften bieten eine unvergleichliche Sequenzierungstiefe und damit einen beispiellosen Einblick in das Funktionieren und die Vielfalt des Erdmikrobioms1. Da die Fähigkeit, immer mehr Proben auf eine einzige Sequenzierungsspur zu multiplen, zunimmt, hat die DNA-Extraktion von Einzelrohren das Potenzial, ein ratenbegrenzender Schritt bei der Generierung ökologischer Daten zu werden. Neue Methoden in DNA-Extraktionen mit hohem Durchsatz versprechen jedoch die Verarbeitung großer Mengen von Umweltproben mit größerer Effizienz als bisher möglich2. Bei diesen Methoden werden häufig 96-Well-Platten anstelle von Einrohren verwendet, wodurch die mögliche Anzahl von Extraktionen erhöht wird, die gleichzeitig auftreten können. Als solche sind die Praktikabilität und Effizienz von Hochdurchsatzextraktionsmethoden offensichtlich und wurden für die Verarbeitung von Umweltproben von Boden3,4 und Pflanzengewebe3,5 bis zu menschlichen Fäkalien2umgesetzt.
Während diese Methoden die Probenverarbeitung und DNA-Extraktion dramatisch beschleunigen können, ist der erste Schritt der Beladung von Boden und anderen ökologischen Proben in 96-Well-Platten anfällig für kreuzprobenübergreifende Kontamination. Diese Art der Brunnenkontamination kann während der DNA-Extraktionen6,7,8und Brunnen in diesem ersten Schritt besonders anfällig sein, bevor Proben in einer Pufferlösung suspendiert werden. McPherson et al.9 demonstrieren eine Methode, um Rhizosphärenböden mit Trichtern und 8-Well-PCR-Streifenabdeckungen in 96-Well-Platten zu laden, aber obwohl ihre Methode ein kontrollierterer Ansatz zum Beladen von Platten ist, bietet sie dennoch reichlich Gelegenheit zur Kontamination benachbarter Brunnen beim Laden jeder Probe. Darüber hinaus ermöglichen die offenen Brunnen einem abgelenkten Forscher die Möglichkeit, eine Probe in den falschen Brunnen zu legen oder eine Probe in einen Brunnen zu geben, der bereits geladen wurde. Darüber hinaus erweisen sich eine Vielzahl von Probentypen als ungeeignet für die Beladung mit diesem Verfahren; Nassproben kleben oft an den Trichtern und trockenen Proben "springen" zwischen Brunnen aufgrund statischer Elektrizität.
Um die Kontaminationsmöglichkeiten zwischen Brunnen im ersten Schritt der DNA-Extraktion mit hohem Durchsatz zu verringern, haben wir einen neuen Ansatz entwickelt, um Bodenproben in 96-Well-Platten zu verladen. Unsere Methoden schützen Brunnen vor Umweltbelastungen und verhindern, dass wir versehentlich mehrere Proben in einen Brunnen laden (Doppelbelastung). Wir glauben, dass die unten beschriebene Methode verspricht, das Kontaminationspotenzial zu verringern und als solches eine kontrolliertere Möglichkeit bietet, 96-Well-Platten für die nachfolgende DNA-Extraktion zu laden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

DNA-Sequenzierungstechniken mit hohem Durchsatz haben wesentlich zu Fortschritten in unserem Verständnis von Beziehungen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften, Host-Eigenschaften und breiteren Ökosystemfunktionen beigetragen. Mit dieser raschen Zunahme der Breite und Tiefe der Sequenzierung sequencing Fähigkeiten haben Methoden zu extrahieren, zu verstärken, analysieren, und interpretieren Umwelt-DNA erfolgreich mit maximaler Effizienz. Leider kann die schnelle Durchführung von DNA-Extraktionen auf Kosten der Erhöhung des Kontaminationsrisikos unter den Proben gehen. Insbesondere Hochdurchsatzextraktionen, die auf Proben basieren, die in einer 96-Well-Platte enthalten sind, bieten im Vergleich zu Einrohrextraktionen eine relativ schnelle Methode, erhöhen aber auch die Möglichkeiten für eine gut zu-gut-kreuz-Kontamination. Um das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Proben zu minimieren und gleichzeitig die Vorteile von Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz beizubehalten, haben wir eine neue Methode entwickelt, um Umweltproben in 96-Well-Platten zu laden. Wir verwendeten durchbohrbare PCR-Dichtungsfolien, um jede Platte während des Ladens von Proben abzudecken, und fügten Proben zuerst zu PCR-Röhren hinzu, bevor wir sie in Brunnen bewegten; Zusammen reduzieren diese Praktiken das Risiko von Probendrift und unbeabsichtigter Doppelbelastung von Brunnen. Die in diesem Papier beschriebene Methode bietet Forschern einen Ansatz zur Maximierung der verfügbaren Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz bei gleichzeitiger Verringerung des Risikos einer Kreuzkontamination, die 96-Well-Platten innewohnt. Wir bieten einen detaillierten Schritt für Schritt, wie man von der Probenentnahme zur DNA-Extraktion übergeht und gleichzeitig das Risiko einer unerwünschten Kreuzkontamination minimiert.

Diese neuartige Methode wurde erfolgreich verwendet, um 96-Well-DNA-Extraktionsplatten zu laden. Der Vergleich der Plattenlademethoden zeigte, dass unsere Methode die niedrigste DNA-Konzentration in den Rohbrunnen aufweist. Die DNA-Konzentration in den Rohbrunnen war signifikant niedriger als die vorgeschlagene Methode mein McPherson et al.9 (p < 0,05), obwohl sich die DNA-Konzentrationen in unserer Methode statistisch nicht von der Qiagen-Standardmethode unterschieden (Abbild...

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Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Aktuelle Methoden zum Beladen von 96-Well-Platten für DNA-Extraktionen können anfällig für Verunreinigungen sein. Wir beschreiben eine neue Methode zum Beladen von 96-Well-Platten, die das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Brunnen reduziert. Unsere Methode wird anderen Forschern helfen, von der Effizienz von DNA-Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz zu profitieren und das Risiko einer Kontamination zu minimieren.

Modifizierte Methoden zum Laden von DNA-Extraktionsplatten mit hohem Durchsatz reduzieren das Kontaminationspotenzial

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Steigerung der Effizienz der 96-Well-DNA-Extraktionsplattenbelastung bei gleichzeitiger Verringerung des Risikos einer Probenkreuzkontamination. Diese Technik reduziert die Kontaminationschancen während des kritischen ersten Schritts der DNA-Extraktion durch die individuelle Zugabe von Proben zu jedem Brunnen in der 96-Well-Platte. Diese Methode kann auf alle bereiche der Mikrobiomforschung angewendet werden.Bevor Sie ein Experiment beginnen, vernebeln Sie die Bank mit 70% Ethanol. Nach dem Wischen die Bank lufttrocknen lassen, bevor sie die Bank mit 10% Bleichmittel besprüht. Nach dem Wischen und Der Lufttrocknung tauchen Sie die mikroskopuläre, spatuläre und gekrümmte chirurgische Schere in 95% Ethanol und setzen die Werkzeuge einer Flamme aus.Dann tauchen Sie jedes Werkzeug in 10% Bleichmittel und lassen Sie die Werkzeuge lufttrocknen. Vor der Unterprobe sterilisiert Ethanol Handschuhe und homogenisiert die Bodenproben gründlich. Weisen Sie als Nächstes jedem Rohr eine Beispiel-ID mit Brunnenposition zu.Füllen Sie 95 beschriftete zwei Milliliter Zentrifugenrohre mit einer Probe pro Tube, bis jedes Rohr etwa halb voll ist. Das 96. Rohr sollte als Extraktionsrohling verwendet werden. Legen Sie die Sub-Probenröhrchen auf Eis und beschriften Sie 96 sterile 200 Mikroliter flach gekappte PCR-Röhren entsprechend den Well-Etiketten für eine 96-Well-Platte, und legen Sie dann das Etikett 200 Mikroliter-Röhren in einem 96-Well-Rack in Ordnung.Um eine 96-Well-Platte für das Experiment vorzubereiten, entfernen Sie die Abdeckung von der Platte und legen Sie die Abdeckung in eine sterile Plastiktüte. Versiegeln Sie den Beutel, um eine Kontamination zu vermeiden, und bedecken Sie die Platte mit einem vorgeschnittenen Stück durchbohrbarer Dichtfolie. Dann verwenden Sie eine Gummiwalze, um die Dichtung fest auf der Platte zu befestigen und die Platte bei vier Grad Celsius zu lagern.Um die Unterproben auf die Platte zu übertragen, legen Sie 24 der zwei Milliliter-Unterprobenröhrchen zur Kaltlagerung in einen Eisblock und wählen Sie anhand des Probennamens und des Gut-Lagebogens die entsprechenden 200 Mikroliter Flachkappenrohre aus. Wirbeln Sie die Subproben nacheinander für fünf Sekunden pro Probe, um die Homogenisierung zu gewährleisten und laden Sie ca. 200 Mikroliter jeder Probe in das entsprechende pcR-Rohr. Wenn alle 24 Proben geladen wurden, verwenden Sie ein gebleichtes getränktes Papiertuch, um die Außenseite eines PCR-Rohrs zu reinigen, und invertiert und tippen Sie auf das Rohr auf der Bank, um die Probe an die Oberseite des Rohres zu bewegen.Mit der Flamme sterilisierte und gebleichte Schere Clip die Unterseite des PCR-Rohrs, um eine Öffnung für die Probe zu schaffen, und übergeben Sie das Rohr über die Platte mit dem Schnitt Ende nach oben, bis der entsprechende Brunnen erreicht ist. Neigen Sie die Platte leicht, um das Punktieren der vorgeschnittenen pierceablen Dichtfolie zu erleichtern, und mit dem Rohr direkt über dem richtigen Brunnen, schnell, aber vorsichtig invertieren Sie die Platte, so dass die geschnittene Spitze in den Brunnen passt. Verwenden Sie ein sterilisiertes Werkzeug, um die Oberseite des Rohres zu tippen, bis der gesamte Boden aus dem Rohr in den Brunnen gefallen ist.Und lassen Sie die Röhre im Brunnen mit der Leitung geschlossen. Wenn alle Proben auf die gleiche Weise geladen wurden, entfernen Sie ein 200 Mikroliter flachkappendes PCR-Rohr und fügen Sie der Probe 750 Mikroliter Perlenlösung hinzu. Legen Sie das 200 Mikroliter flache PCR-Rohr wieder in den Brunnen, der es den ganzen Weg hinunter in den Brunnen drückt.Und verwenden Sie einen Sharpie, um die Oberseite des Rohres zu markieren, um anzuzeigen, dass der Brunnen geladen wurde. Wenn alle Brunnen mit Perlen beladen sind, kehren die 24 Probenröhrchen auf 20 Grad Celsius Lagerung zurück und fügen 24 neue Sub-Probenröhren in den Eisblock, damit der nächste Satz von Proben in die 96-Well-Platte geladen werden kann, wie gerade gezeigt. Wenn alle 95 Brunnen mit Proben- und Perlenlösung beladen wurden, fügen Sie die Perlenlösung nur zum 96. Brunnen hinzu.Entfernen Sie alle Rohre, übergeben Sie sie nur über überdachte Brunnen und entfernen Sie vorsichtig den durchbohrbaren Film von der Platte. Dann die Plattenabdeckung vorsichtig aus dem Plastikbeutel auf die Platte geben und die Platte bis zur geplanten Extraktion bei 20 Grad Celsius platzieren. Ein Vergleich der Plattenlademethoden zeigt, dass die demonstrierte Methode zu der niedrigsten DNA-Konzentration in den Rohbrunnen führt.Mit dieser Methode war die DNA-Konzentration signifikant niedriger als bei der Anwendung der von McPherson et al. vorgeschlagenen Methode. Obwohl die DNA-Konzentration nach dieser Methode statistisch nicht von der Qiagen-Standardmethode abdifferenzierunge. Alle drei Methoden produzieren mittlere DNA-Konzentrationen unter zwei Nanogramm pro Mikroliter.Obwohl nur diese neue Methode Brunnen ohne messbare DNA-Konzentration produziert. Um das Verschüttungspotenzial zu minimieren, halten Sie das 200-Mikroliter-Rohr aufrecht, wenn Sie es über die Platte bewegen, kippen Sie die Platte und setzen Sie das Rohr in den richtigen Brunnen ein.

Research

JoVE Journal

Biology

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