Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי המיקרוביאלית אקולוגיה שיתוף פעולה עם מימון מNSF פרס #EPS-1655726.

1. ספסל מעבדה והכנת כלי להעמסת צלחת 96 באר
<ol><li>ספסל נקי על ידי ערפל עם 70% אתנול. מנגבים ותנו לאוויר להתייבש לפני ריסוס הספסל עם 10% אקונומיקה. נגב את הספסל יבש.</li>
	<li>לחטא מיקרו סקופולה, מרית, ומספריים כירורגיים (מעוקל) על ידי טבילה ב 95% אתנול ולאחר מכן לחשוף להבה. טובלים כל אחד ב-10% אקונומיקה ומאפ...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

שיטה זו מפחיתה הזדמנויות לזיהום צולב היטב תוך טעינת לוחות חילוץ מדגם בתפוקה גבוהה ומציעה אמצעי מבוקר יותר לטעון 96-well צלחות מעבר אסטרטגיות טעינתצלחת קיימות 9,10. זיהום בין בארות יכול להיות מתפשט יותר בחילוץ צלחת 96-גם מאשר בעיות צינור יחיד, במיוחד כאשר<sup class="xref...

ההתפתחויות האחרונות בהקפת תפוקה גבוהה של קהילות מיקרוביאליות מספקות עומק רצף שאין שני לו, וכתוצאה מכך, הצצה לא מנומקת לתפקוד ולמגוון של המיקרוביום1 של כדור הארץ. ככל שהיכולת לדגום יותר ויותר דגימות על נתיב רצף יחיד גדלה, חילוץ DNA צינור יחיד יש פוטנציאל להפוך צעד הגבלת קצב בדור של נתונים אקולוגיים. עם זאת, שיטות חדשות בתפוקה גבוהה עקירות DNA להחזיק הבטחה לעיבוד כמויות גדולות של דגימות סביבתיות עם יעילות רבה יותר מאשר בעבר היה אפשרי2. שיטות אלה כרוכות לעתים קרובות באמצעות 96-באר צלחות במקום חד צינוריות, ובכך להגדיל את המספר האפשרי של עקירות שיכולות להתרחש בו זמנית. בתור שכזה, המעשיות והיעילות של שיטות חילוץ בתפוקה גבוהה ניכרות ומיושמות לעיבוד דגימות סביבתיות החלקרקע 3,,4 ורקמות צמח3,,5 כדי חומר צואתי אנושי2.
בעוד שיטות אלה יכול להאיץ באופן דרמטי לאורך עיבוד מדגם וחילוץ DNA, השלב הראשוני של טעינת קרקע ודגימות אקולוגיות אחרות לתוך 96-באר צלחות הוא רגיש זיהום חוצה דגימות. סוג זה של זיהום טוב יכול להתרחשבמהלךעקירות DNA 6,7,8 , בארות פגיעותבמיוחדבשלב הראשון זה לפני דגימות מושהות בתמיסת חיץ. McPherson ואח'9 להפגין שיטה לטעון קרקעות rhizosphere לתוך 96-גם צלחות באמצעות משפך ו8-well כיסויים רצועת PCR, אבל בעוד השיטה שלהם היא גישה מבוקרת יותר לטעינת צלחות, זה עדיין מספק הזדמנות מספיקה לזיהום של בארות שכנות בעת טעינת כל מדגם. בנוסף, בארות פתוחות לאפשר את ההזדמנות עבור חוקר מוסח למקם דגימה לתוך הבאר הלא נכונה או להוסיף דגימה לתוך באר שכבר נטען. בנוסף, מגוון סוגי דגימות להוכיח להיות לא מתאים לטעינה עם שיטה זו; דגימות רטובות לעתים קרובות להיצמד משפך ודגימות יבש 'לקפוץ' בין בארות בשל חשמל סטטי.
כדי להפחית את ההזדמנויות לזיהום בין בארות בשלב הראשון של עקירות DNA בתפוקה גבוהה, פיתחנו גישה חדשה להעמסת דגימות קרקע לתוך צלחות 96-באר. השיטות שלנו מגנות על בארות מפני חשיפה סביבתית ומונעות מאיתנו לטעון בטעות דגימות מרובות לבאר אחת (טעינה כפולה). אנו מאמינים השיטה שדווחה להלן מבטיח להפחית את הפוטנציאל לזיהום ולכן מספק אמצעי מבוקר יותר לטעון 96-well צלחות עבור הפקת DNA עוקבות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

טכניקות רצף DNA בתפוקה גבוהה תרמו באופן משמעותי להתקדמות בהבנת מערכות היחסים שלנו בין קהילות מיקרוביאליות, מאפייני מארחים ופונקציות אקוסיסטם רחבות יותר. עם עלייה מהירה זו ברוחב ועומק של יכולות רצף הגיעו שיטות לחלץ, להגביר, לנתח ולפרש DNA סביבתי בהצלחה ביעילות מקסימלית. למרבה הצער, ביצוע עקירות DNA במהירות יכול לבוא במחיר של הגדלת הסיכון לזיהום בין דגימות. בפרט, עקירות בתפוקה גבוהה המבוססות על דגימות הכלולות בצלחת 96-באר מציעות שיטה מהירה יחסית, בהשוואה עקירות צינור יחיד, אבל גם להגדיל את ההזדמנויות עבור טוב לבאר זיהום צולב. כדי למזער את הסיכון לזיהום צולב בין דגימות, תוך שמירה על היתרונות של טכניקות חילוץ בתפוקה גבוהה, פיתחנו שיטה חדשה לטעינת דגימות סביבתיות לתוך צלחות 96 באר. השתמשנו בסרטי איטום PCR הניתנים לפינוק כדי לכסות כל צלחת תוך טעינת דגימות והוספנו דגימות תחילה לצינורות PCR לפני העברתן לבארות; יחד, שיטות אלה להפחית את הסיכון של סחיפה מדגם וטעינה כפולה לא מכוונת של בארות. השיטה המתוארת בנייר זה מספקת לחוקרים גישה למקסם את טכניקות החילוץ הזמינות בתפוקה גבוהה תוך הפחתת הסיכון לזיהום צולב הטבוע בצלחות של 96 בארות. אנו מספקים מתאר מפורט שלב אחר שלב של איך לעבור מאיסוף מדגם לחילוץ DNA תוך מזעור הסיכון של זיהום צולב לא רצוי.

שיטה חדשנית זו שימשה בהצלחה כדי לטעון 96-well חילוץ לוחות. השוואה בין שיטות טעינת לוחות הראתה את השיטה שלנו שיש ריכוז ה-DNA הנמוך ביותר בארות ריקות. ריכוז ה-DNA בארות הריקות היה נמוך משמעותית מהשיטה המוצעת מקפירסון ואח'שלי (p < 0.05), אם כי ריכוזי ה-DNA בשיטה שלנו לא היו שונים סטטיסטית משיט?...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

שיטות נוכחיות לטעינת צלחות 96-באר עבור עקירות DNA יכול להיות נוטה זיהום. אנו מפרטים שיטה חדשה לטעינת צלחות 96-באר המפחיתה את הסיכון לזיהום צולב בין בארות. השיטה שלנו תסייע לחוקרים אחרים לנצל את היעילות של טכניקות חילוץ DNA בתפוקה גבוהה ולמזער את הסיכון לזיהום.

שיטות ששונו לטעינת לוחות מיצוי DNA בתפוקה גבוהה להפחית את הפוטנציאל לזיהום

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

פרוטוקול זה מספק טכניקה להגברת היעילות של טעינת צלחת מיצוי DNA 96 באר בעת ובעונה אחת להקטין את הסיכון של זיהום לחצות מדגם. טכניקה זו מפחיתה את הסיכויים לזיהום במהלך השלב הראשון הקריטי של מיצוי DNA באמצעות תוספת אישית של דגימות לכל באר בצלחת 96-well. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כל אחד מהתחומים המגוונים של מחקר המיקרוביום.לפני תחילת ניסוי, ערפל העליון הספסל עם 70% אתנול. לאחר הניגוב, תנו לספסל להתייבש באוויר לפני שריססו את הספסל ב-10% אקונומיקה. לאחר הניגוב וייבוש האוויר, טובלים את המספריים המיקרוסקופיים, המרוחיים והמסובבים לתוך 95% אתנול וחושפים את הכלים ללהבה.לאחר מכן טובלים כל כלי ב-10% אקונומיקה ומאפשרים לכלים להתייבש באוויר. לפני תת דגימה, אתנול לעקר כפפות ביסודיות הומוגניזציה דגימות הקרקע. לאחר מכן הקצה מזהה לדוגמה עם מיקום טוב לכל צינור.למלא 95 שכותרתו שני צינורות צנטריפוגה מיליליטר עם מדגם אחד לכל צינור, עד כל צינור הוא כחצי מלא. הצינור ה-96 צריך לשמש כחילוץ ריק. מניחים את צינורות תת מדגם על קרח, ולתייג 96 סטרילי 200 צינורות PCR שטוח כובע מיקרוליטר על פי תוויות באר עבור צלחת 96 היטב, ולאחר מכן למקם את התווית 200 צינורות microliter לפי הסדר בארון מתלה 96 באר.כדי להכין צלחת 96 באר לניסוי, להסיר את הכיסוי מהצלחת ולה מניחים את המכסה לתוך שקית ניילון סטרילית. לאטום את השקית כדי למנוע זיהום ולכסות את הצלחת עם חתיכה לחתוך מראש של סרט איטום פירסינג. לאחר מכן השתמש רולר גומי כדי לדבוק בחוזקה את החותם לצלחת ולאחסן את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס.כדי להעביר את דגימות המשנה לצלחת, מקם 24 מתוך שני צינורות תת הדגימה המיליליטר לתוך גוש קרח לאחסון קר, ולהשתמש שם המדגם ואת גיליון מיקום היטב כדי לבחור את המתאים המתאים 200 צינורות שטוחים שטוחים microliter. Vortex תת דגימות אחד בכל פעם, במשך חמש שניות לכל מדגם כדי להבטיח הומוגניזציה לטעון כ 200 microliters של כל מדגם לתוך צינור PCR המתאים המתאים. כאשר כל 24 הדגימות נטענו, השתמש במגבון נייר ספוג מולבן כדי לנקות את החלק החיצוני של צינור PCR אחד, ולהפוך ולהקש על הצינור על הספסל כדי להעביר את המדגם לראש הצינור.באמצעות הלהבה מעקרת ומספריים מולבן לקצץ את החלק התחתון של צינור PCR כדי ליצור פתח עבור המדגם, ולהעביר את הצינור מעל הצלחת עם הקצה לחתוך פונה עד הבאר המתאימה הושגה. להטות את הצלחת מעט, כדי להקל על ניקוב של סרט איטום פירסינג לחתוך מראש, ועם הצינור ישירות מעל הבאר הנכונה, במהירות אך בזהירות להפוך את הצלחת, כך קצה לחתוך מתאים לתוך הבאר. השתמש בכלי מעוקר כדי להקיש על החלק העליון של הצינור עד שכל האדמה נפלה מהצינור לתוך באר.ולהשאיר את הצינור באר עם העופרת סגורה. כאשר כל הדגימות נטענו באותו אופן, להסיר צינור PCR שטוח אחד 200 microliter ולהוסיף 750 microliters של פתרון חרוזים לדגימה היטב. מניחים את צינור PCR 200 microliter שטוח כתרים בחזרה לתוך באר דוחף אותו כל הדרך למטה לתוך באר.ולהשתמש שארפי כדי לסמן את החלק העליון של הצינור כדי לציין את באר נטען. כאשר כל הבארות כבר טעון עם חרוזים להחזיר את 24 צינורות מדגם ל 20 מעלות צלזיוס אחסון ולהוסיף 24 צינורות תת מדגם חדש לגוש הקרח, כדי לאפשר את הסט הבא של דגימות להיות טעון לתוך צלחת 96 היטב כפי שהודגם רק. כאשר כל 95 בארות כבר טעון עם מדגם פתרון חרוזים, להוסיף פתרון חרוזים רק לבא 96.הסר את כל הצינורות, מעביר אותם מעל בארות מכוסות בלבד ומסיר בזהירות את הסרט הניתן לנקב מהצלחת. לאחר מכן מעבירים בזהירות את כיסוי הצלחת משקית הניילון לצלחת ומ מניחים את הצלחת על 20 מעלות צלזיוס עד החילוץ המתוכנן. השוואה של שיטות טעינת לוח מראה כי השיטה המודגמת גורמת לריכוז הדנ"א הנמוך ביותר בתוך הבאר הריקה.בשיטה זו, ריכוז ה-DNA היה נמוך משמעותית אז בעת שימוש בשיטה המוצעת על ידי McPherson ואח '. למרות שריכוז הדנ"א בשיטה זו לא היה שונה סטטיסטית משיטת ברירת המחדל של qiagen. כל שלוש השיטות, לייצר ריכוזי DNA ממוצעים תחת שני ננוגרם למיקרוליטר.למרות שרק שיטה חדשה זו מייצרת בארות ללא ריכוז דנ"א מדיד. כדי למזער את הפוטנציאל לשפוך, לשמור על צינור 200 microliter זקוף בעת הזזת אותו מעל הצלחת, להטות את הצלחת ולהכניס את הצינור לתוך הטוב הנכון.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

שיטות להפקת endosymbionts מן Whitefly<em&gt; Bemisia Tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

פרופיל מטבולי בעל תפוקה גבוהה לעידון מודלים של אצות מיקרו

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...