Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
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इस शोध को एनएसएफ अवार्ड #EPS-1655726 से फंडिंग के साथ माइक्रोबियल इकोलॉजी सहयोगी ने समर्थन दिया था ।

1. प्रयोगशाला बेंच और एक ९६ अच्छी तरह से थाली लोड करने के लिए उपकरण की तैयारी
<ol><li>70% इथेनॉल के साथ गलत करके बेंच टॉप को साफ करें। पोंछें और 10% ब्लीच के साथ बेंच टॉप छिड़काव से पहले हवा सूखने दें। बेंच टॉप ड्र?...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

यह विधि उच्च-थ्रूपुट नमूना निष्कर्षण प्लेटें लोड करते समय अच्छी तरह से क्रॉस-संदूषण के अवसरों को कम करती है और मौजूदा प्लेट लोडिंग रणनीतियों9,10से परे 96-अच्छी प्लेटों को लोड करने के लिए अधिक...

माइक्रोबियल समुदायों के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण में हाल की प्रगति अद्वितीय अनुक्रमण गहराई प्रदान कर रही है और इसके परिणामस्वरूप, पृथ्वी के माइक्रोबायोम1के कामकाज और विविधता में एक अप्रत्याशित झलक । चूंकि एक अनुक्रमण लेन पर अधिक से अधिक नमूनों को मल्टीप्लेक्स करने की क्षमता बढ़ जाती है, एकल ट्यूब डीएनए निष्कर्षण में पारिस्थितिक डेटा की पीढ़ी में दर-सीमित कदम बनने की क्षमता है। हालांकि, उच्च थ्रूपुट डीएनए निष्कर्षण में नए तरीके पहले से संभव होने की तुलना में अधिक दक्षता के साथ बड़ी मात्रा में पर्यावरणीय नमूनों को संसाधित करने का वादा करतेहैं। इन तरीकों में अक्सर एकल ट्यूबों के बजाय 96-अच्छी प्लेटों का उपयोग करना शामिल होता है, जिससे एक साथ होने वाले निष्कर्षों की संभावित संख्या बढ़ जाती है। इस प्रकार, उच्च-थ्रूपुट निष्कर्षण विधियों की व्यावहारिकता और दक्षता स्पष्ट है और इसे मिट्टी3, 4और पौधों के ऊतकों,3,5 से लेकर मानव मल पदार्थ2तक के पर्यावरणीय नमूनों के प्रसंस्करण के लिए लागू किया गया है।5 2
हालांकि इन तरीकों नाटकीय रूप से नमूना प्रसंस्करण और डीएनए निष्कर्षण के साथ गति कर सकते हैं, ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में मिट्टी और अंय पारिस्थितिक नमूनों लोड करने का प्रारंभिक कदम पार नमूना संदूषण के लिए अतिसंवेदनशील है । इस प्रकार का अच्छी तरह से संदूषण डीएनए निष्कर्षण6,7, 8केदौरानहो सकता है और नमूनों को बफर समाधान में निलंबित किए जाने से पहले इस पहले चरण में कुएं विशेष रूप से कमजोर होते हैं।, मैकफर्सन एट अल9 फ़नल और 8-अच्छी तरह से पीसीआर स्ट्रिप कवर का उपयोग करके 96-अच्छी तरह से प्लेटों में राइजोस्फीयर मिट्टी लोड करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करता है, लेकिन जब उनकी विधि प्लेटों को लोड करने के लिए एक अधिक नियंत्रित दृष्टिकोण है, तो यह अभी भी प्रत्येक नमूने को लोड करते समय पड़ोसी कुओं के प्रदूषण के लिए पर्याप्त अवसर प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, खुले कुओं एक विचलित शोधकर्ता के लिए मौका गलत अच्छी तरह से एक नमूना जगह या एक अच्छी तरह से है कि पहले से ही लोड किया गया है में एक नमूना जोड़ने के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, विभिन्न प्रकार के नमूना प्रकार इस विधि के साथ लोडिंग के लिए बीमार साबित होते हैं; गीले नमूने अक्सर स्थिर बिजली के कारण कुओं के बीच फ़नल और सूखे नमूनों 'कूद' से चिपके रहते हैं।
उच्च थ्रूपुट डीएनए अर्क के पहले कदम में कुओं के बीच संदूषण के अवसरों को कम करने के लिए, हमने मिट्टी के नमूनों को ९६-अच्छी प्लेटों में लोड करने के लिए एक नया दृष्टिकोण विकसित किया । हमारे तरीके दोनों पर्यावरण जोखिम से कुओं की रक्षा और हमें गलती से एक अच्छी तरह से (डबल लोडिंग) में कई नमूनों लोड से रोकने के । हमारा मानना है कि नीचे रिपोर्ट की गई विधि संदूषण की क्षमता को कम करने का वादा करती है और इस तरह बाद के डीएनए निष्कर्षण के लिए ९६-अच्छी प्लेटों को लोड करने के लिए अधिक नियंत्रित साधन प्रदान करती है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

उच्च थ्रूपुट डीएनए अनुक्रमण तकनीकों ने माइक्रोबियल समुदायों, मेजबान विशेषताओं और व्यापक पारिस्थितिकी तंत्र कार्यों के बीच संबंधों की हमारी समझ में प्रगति में काफी योगदान दिया है। विस्तार क्षमताओं की चौड़ाई और गहराई में इस तेजी से वृद्धि के साथ अधिकतम दक्षता के साथ सफलतापूर्वक पर्यावरण डीएनए निकालने, बढ़ाना, विश्लेषण करने और व्याख्या करने के तरीके आए हैं। दुर्भाग्य से, डीएनए निष्कर्षण जल्दी से प्रदर्शन नमूनों के बीच संदूषण के जोखिम को बढ़ाने की कीमत पर आ सकता है । विशेष रूप से, उच्च-थ्रूपुट निष्कर्षण जो 96-अच्छी प्लेट में निहित नमूनों पर आधारित होते हैं, एकल-ट्यूब निष्कर्षण की तुलना में अपेक्षाकृत त्वरित विधि प्रदान करते हैं, लेकिन अच्छी तरह से क्रॉस-संदूषण के अवसरों में भी वृद्धि करते हैं। नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, उच्च थ्रूपुट निष्कर्षण तकनीकों के लाभों को बनाए रखते हुए, हमने पर्यावरणीय नमूनों को 96-अच्छी प्लेटों में लोड करने के लिए एक नई विधि विकसित की। हमने नमूने लोड करते समय प्रत्येक प्लेट को कवर करने के लिए पियर्सेबल पीसीआर सीलिंग फिल्मों का उपयोग किया और उन्हें कुओं में ले जाने से पहले पीसीआर ट्यूबों में पहले नमूने जोड़े; साथ में, ये प्रथाएं नमूने बहाव और कुओं की अनपेक्षित डबल लोडिंग के जोखिम को कम करते हैं। इस पेपर में उल्लिखित विधि शोधकर्ताओं को उपलब्ध उच्च-थ्रूपुट निष्कर्षण तकनीकों को अधिकतम करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करती है, जबकि ९६-अच्छी प्लेटों के लिए निहित क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करती है । हम अवांछित क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करते हुए नमूना संग्रह से डीएनए निष्कर्षण तक कैसे स्थानांतरित किया जाए, इसकी विस्तृत रूपरेखा प्रदान करते हैं।

इस उपन्यास विधि का उपयोग 96-अच्छी तरह से डीएनए निष्कर्षण प्लेटों को लोड करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था। प्लेट लोडिंग विधियों की तुलना में खाली कुओं में सबसे कम डीएनए एकाग्रता के लिए हमारी विधि दिखा...

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Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

डीएनए अर्क के लिए ९६-अच्छी प्लेटें लोड करने के लिए वर्तमान तरीकों संदूषण के लिए प्रवण हो सकता है । हम ९६-अच्छी प्लेटों को लोड करने के लिए एक नई विधि का विस्तार करते हैं जो कुओं के बीच क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करता है । हमारी विधि अन्य शोधकर्ताओं को उच्च थ्रूपुट डीएनए निष्कर्षण तकनीकों की दक्षता को भुनाने और संदूषण के जोखिम को कम करने में मदद करेगी।

उच्च थ्रूपुट डीएनए निष्कर्षण प्लेटों के लोडिंग के लिए संशोधित तरीके संदूषण के लिए क्षमता को कम करते हैं

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

यह प्रोटोकॉल 96-अच्छी तरह से डीएनए निष्कर्षण प्लेट लोडिंग की दक्षता बढ़ाने के लिए एक तकनीक प्रदान करता है, जबकि साथ ही नमूना पार संदूषण के जोखिम को कम करता है। इस तकनीक को ९६-अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से नमूनों के व्यक्तिगत इसके अलावा के माध्यम से डीएनए निष्कर्षण के महत्वपूर्ण पहले कदम के दौरान संदूषण के लिए संभावना कम कर देता है । इस पद्धति माइक्रोबायोम अनुसंधान के विविध क्षेत्रों में से किसी के लिए लागू किया जा सकता है।एक प्रयोग शुरू करने से पहले, 70% इथेनॉल के साथ बेंच शीर्ष धुंध। पोंछने के बाद बेंच को 10% ब्लीच के साथ छिड़काव करने से पहले बेंच को हवा-सूखा कर दें। पोंछने और हवा सुखाने के बाद, माइक्रोस्कोपुलर, स्पैलर, और घुमावदार सर्जिकल कैंची को 95% इथेनॉल में डुबोएं और उपकरणों को लौ में बेनकाब करें।फिर प्रत्येक उपकरण को 10% ब्लीच में डुबोएं और उपकरणों को हवा-सूखी होने दें। उप-नमूने से पहले, इथेनॉल दस्ताने को स्टरलाइज करता है और मिट्टी के नमूनों को अच्छी तरह से समरूप बनाता है। इसके बाद प्रत्येक ट्यूब को अच्छी तरह से स्थान के साथ एक नमूना आईडी असाइन करें।भरें ९५ ट्यूब प्रति एक नमूना के साथ दो मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब लेबल, जब तक प्रत्येक ट्यूब लगभग आधा भरा है । 96 वीं ट्यूब एक निकासी खाली के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। बर्फ पर उप नमूना ट्यूबों प्लेस, और लेबल ९६ बाँझ २०० माइक्रोलीटर फ्लैट-कैप्ड पीसीआर ट्यूबए९६-अच्छी तरह से थाली के लिए अच्छी तरह से लेबल के अनुसार, तो एक ९६ अच्छी तरह से रैक में क्रम में लेबल २०० माइक्रोलीटर ट्यूब जगह है ।प्रयोग के लिए 96-वेल प्लेट तैयार करने के लिए, प्लेट से कवर को हटा दें और कवर को बाँझ प्लास्टिक बैग में रखें। प्रदूषण को रोकने के लिए बैग को सील करें और प्लेट को पियर्सेबल सीलिंग फिल्म के पूर्व-कट टुकड़े के साथ कवर करें। फिर प्लेट को सील का दृढ़ता से पालन करने के लिए एक रबर रोलर का उपयोग करें और प्लेट को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।उप-नमूनों को प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए, दो मिलीलीटर उप-नमूना ट्यूबों में से 24 को कोल्ड स्टोरेज के लिए आइस ब्लॉक में रखें, और उपयुक्त संबंधित 200 माइक्रोलीटर फ्लैट-कैप्ड ट्यूबों का चयन करने के लिए नमूना नाम और अच्छी तरह से स्थान पत्रक का उपयोग करें। भंवर एक समय में उप-नमूनों को एक बार में, प्रति नमूना पांच सेकंड के लिए समरूपता सुनिश्चित करने के लिए और उपयुक्त संबंधित पीसीआर ट्यूब में प्रत्येक नमूने के लगभग 200 माइक्रोलीटर लोड करने के लिए। जब सभी 24 नमूनों को लोड किया गया है, एक प्रक्षालित लथपथ कागज पोंछ का उपयोग करने के लिए एक पीसीआर ट्यूब के बाहर साफ है, और उलटा और ट्यूब के ऊपर करने के लिए नमूना स्थानांतरित करने के लिए बेंच पर ट्यूब नल ।लौ निष्फल और प्रक्षालित कैंची का उपयोग करने के लिए नमूना के लिए एक खोलने बनाने के लिए पीसीआर ट्यूब के नीचे क्लिप, और कटौती अंत के साथ थाली पर ट्यूब पारित जब तक उचित अच्छी तरह से पहुंच गया है । प्लेट को थोड़ा झुकाएं, पूर्व-कट पियर्सबल सीलिंग फिल्म के पंचर की सुविधा के लिए, और ट्यूब के साथ सीधे सही कुएं से ऊपर, जल्दी से लेकिन ध्यान से प्लेट को उलटा करें ताकि कट टिप अच्छी तरह से फिट हो जाए। ट्यूब के शीर्ष पर टैप करने के लिए एक निष्फल उपकरण का उपयोग करें जब तक कि सभी मिट्टी ट्यूब से कुएं में गिर न जाए।और सीसा बंद के साथ कुएं में ट्यूब छोड़ दें। जब सभी नमूनों को एक ही तरीके से लोड किया गया है, तो एक 200 माइक्रोलीटर फ्लैट-कैप्ड पीसीआर ट्यूब को हटा दें और नमूना कुएं में मनका समाधान के 750 माइक्रोलीटर जोड़ें। २०० माइक्रोलिटर फ्लैट-छाया पीसीआर ट्यूब वापस अच्छी तरह से यह सब तरह से नीचे अच्छी तरह से धक्का में रखें ।और अच्छी तरह से लोड किया गया है संकेत करने के लिए ट्यूब के शीर्ष को चिह्नित करने के लिए एक Sharpie का उपयोग करें। जब कुओं के सभी मोतियों के साथ लोड किया गया है 24 नमूना ट्यूबों 20 डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए वापस और बर्फ ब्लॉक करने के लिए 24 नए उप नमूना ट्यूबों जोड़ने के लिए, नमूनों के अगले सेट ९६ में लोड करने की अनुमति के रूप में अच्छी तरह से थाली के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया । जब सभी 95 कुओं को नमूना और मनका समाधान के साथ लोड किया गया है, तो केवल 96 वें कुएं में मनका समाधान जोड़ें।सभी ट्यूबों को हटा दें, उन्हें केवल कवर किए गए कुओं पर गुजरें और ध्यान से प्लेट से पियर्सेबल फिल्म को हटा दें। फिर ध्यान से प्लेट कवर को प्लास्टिक बैग से प्लेट में स्थानांतरित करें और प्लेट को नियोजित निष्कर्षण तक 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। प्लेट लोडिंग विधियों की तुलना से पता चलता है कि प्रदर्शन विधि के परिणामस्वरूप खाली कुओं के भीतर सबसे कम डीएनए एकाग्रता होती है।इस विधि का उपयोग करना, मैकफर्सन एट अल द्वारा प्रस्तावित विधि का उपयोग करते समय डीएनए एकाग्रता काफी कम थी। हालांकि इस विधि से डीएनए एकाग्रता qiagen डिफ़ॉल्ट विधि से सांख्यिकीय रूप से अलग नहीं थे। सभी तीन तरीकों, माइक्रोलीटर प्रति दो नैनोग्राम के तहत मतलब डीएनए सांद्रता का उत्पादन ।हालांकि केवल इस नई विधि कोई औसत दर्जे का डीएनए एकाग्रता के साथ कुओं का उत्पादन । बिखराव की क्षमता को कम करने के लिए, 200 माइक्रोलीटर ट्यूब को प्लेट के ऊपर ले जाते समय सीधा रखें, प्लेट को झुकाएं और ट्यूब को सही कुएं में डालें।

Research

JoVE Journal

Biology

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