Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
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Questa ricerca è stata supportata dal Microbial Ecology Collaborative con il finanziamento del premio NSF #EPS-1655726.

1. Panca di laboratorio e preparazione dell'utensile per il caricamento di una piastra da 96
<ol><li>Panca chiara con 70% di etanolo. Pulire e lasciare asciugare l'aria prima di spruzzare panca con 10% di candeggina. Pulire la panca asciutta.</li>
	<li>Sterilizzare micro-scoopula, spatola e forbici chirurgiche (curve) immergendo nel 95% l'etanolo e quindi esporre a una fiamma. Immergere ciascuno in candeggina 10% e lasciare asciugare l'aria prima dell'uso. NOTA: gli utensili devono essere sterilizzati tra ogni campi...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

Questo metodo riduce le opportunità di contaminazione incrociata ben elevata durante il caricamento di piastre di estrazione del campione ad alta velocità di produzione e offre un mezzo più controllato per caricare piastre a 96 pori oltre le strategie di caricamento delle piastreesistenti 9,10. La contaminazione tra pozzi può essere più pervasiva nelle estrazioni di lastre di 96 pozzi rispetto alle estrazioni a tubo singolo, soprattutto quando<sup class="xre...

I recenti progressi nel sequenziamento ad alto rendimento delle comunità microbiche stanno fornendo una profondità di sequenziamento senza precedenti e, di conseguenza, uno sguardo senza precedenti sul funzionamento e la diversità del microbiomaterrestre 1. Con l'aumentare della capacità di multiplex sempre più campioni su una singola corsia di sequenziamento, l'estrazione del DNA a tubo singolo potrebbe diventare un passo limitante nella generazione di dati ecologici. Tuttavia, i nuovi metodi nelle estrazioni di DNA ad alto rendimento promettono di elaborare grandi quantità di campioni ambientali con una maggiore efficienza di quanto sia stato possibile inprecedenza 2. Questi metodi spesso comportano l'utilizzo di piastre di 96-pozzo invece di tubi singoli, aumentando così il possibile numero di estrazioni che possono verificarsi contemporaneamente. Di conseguenza, la praticità e l'efficienza dei metodi di estrazione ad alto rendimento sono evidenti e sono state implementate per la lavorazione di campioni ambientali che vannodal suolo 3,4 e tessutivegetali 3,5 alla materia fecaleumana 2.
Mentre questi metodi possono accelerare notevolmente lungo l'elaborazione dei campioni e l'estrazione del DNA, la fase iniziale di caricamento del suolo e di altri campioni ecologici in piastre a 96 po 'è suscettibile alla contaminazione da campioni incrociati. Questo tipo di contaminazione ben bene può verificarsi durante le estrazioni di DNA6,7,8e i pozzi sono particolarmente vulnerabili in questa prima fase prima che i campioni siano sospesi in una soluzione tampone. McPherson et al.9 dimostrano un metodo per caricare i suoli di rizosfera in lastre di 96 pozzi utilizzando imbuti e coperture a strisce PCR a 8 pozzi, ma mentre il loro metodo è un approccio più controllato al caricamento delle piastre, offre ancora ampie opportunità per la contaminazione dei pozzi vicini durante il caricamento di ogni campione. Inoltre, i pozzi aperti permettono la possibilità per un ricercatore distratto di inserire un campione nel pozzo non corretto o aggiungere un campione in un pozzo che è già stato caricato. Inoltre, una varietà di tipi di campione si rivelano inadatto per il caricamento con questo metodo; i campioni umidi spesso si attaccano agli imbuti e i campioni secchi "saltano" tra i pozzetti a causa dell'elettricità statica.
Per ridurre le opportunità di contaminazione tra i pozzi nella prima fase delle estrazioni di DNA ad alto rendimento, abbiamo sviluppato un nuovo approccio per caricare campioni di terreno in piastre a 96 pozzi. I nostri metodi proteggono i pozzi dall'esposizione ambientale e ci impediscono di caricare accidentalmente più campioni in un unico pozzo (doppio caricamento). Crediamo che il metodo riportato di seguito offra una promessa per ridurre il potenziale di contaminazione e come tale fornisce un mezzo più controllato per caricare piastre a 96 po 'per la successiva estrazione del DNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

Tecniche di sequenziamento del DNA ad alto rendimento hanno contribuito notevolmente a far progredire la nostra comprensione delle relazioni tra le comunità microbiche, le caratteristiche dell'ospite e le funzioni più ampie dell'ecosistema. Con questo rapido aumento di ampiezza e profondità delle capacità di sequenziamento sono venuti metodi per estrarre, amplificare, analizzare e interpretare il DNA ambientale con successo con la massima efficienza. Purtroppo, l'esecuzione rapida di estrazioni di DNA può costare il rischio di contaminazione tra i campioni. In particolare, le estrazioni ad alta velocità che si basano su campioni contenuti in una piastra di 96 po 'offrono un metodo relativamente veloce, rispetto alle estrazioni a tubo singolo, ma aumentano anche le opportunità di contaminazione incrociata ben bene. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione incrociata tra i campioni, pur mantenendo i benefici delle tecniche di estrazione ad alto rendimento, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per caricare campioni ambientali in piastre a 96 poteggiamenti. Abbiamo usato pellicole di tenuta PCR forabili per coprire ogni piastra durante il caricamento dei campioni e abbiamo aggiunto campioni prima ai tubi PCR prima di spostarli in pozzi; insieme, queste pratiche riducono il rischio di deriva del campione e di doppio carico involontario di pozzi. Il metodo descritto in questo documento fornisce ai ricercatori un approccio per massimizzare le tecniche di estrazione ad alto rendimento disponibili, riducendo al contempo il rischio di contaminazione incrociata inerente alle piastre a 96 pozze. Forniamo una descrizione dettagliata passo dopo passo di come passare dalla raccolta dei campioni all'estrazione del DNA, riducendo al minimo il rischio di contaminazione incrociata indesiderata.

Questo nuovo metodo è stato utilizzato con successo per caricare lastre di estrazione del DNA di 96-well. Il confronto dei metodi di caricamento delle placche ha mostrato il nostro metodo per avere la più bassa concentrazione di DNA nei pozzi vuoti. La concentrazione del DNA nei pozzi vuoti era significativamente inferiore al metodo proposto il mio McPherson et al.9 (p < 0.05), anche se le concentrazioni di DNA nel nostro metodo non erano statisticamente diverse dal metodo di default Qiagen (<st...

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Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Gli attuali metodi per il caricamento di piastre di 96 well per le estrazioni di DNA possono essere soggetti a contaminazione. Dettagliamo un nuovo metodo per caricare piastre a 96 pozzi che riduce il rischio di contaminazione incrociata tra i pozzetti. Il nostro metodo aiuterà altri ricercatori a capitalizzare l'efficienza delle tecniche di estrazione del DNA ad alto rendimento e a ridurre al minimo il rischio di contaminazione.

Metodi modificati per il caricamento di piastre di estrazione del DNA ad alta velocità effettiva riducono il potenziale di contaminazione

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Questo protocollo fornisce una tecnica per aumentare l'efficienza del caricamento della piastra di estrazione del DNA a 96 pozzi riducendo allo stesso tempo il rischio di contaminazione incrociata del campione. Questa tecnica riduce le possibilità di contaminazione durante la prima fase critica dell'estrazione del DNA attraverso l'aggiunta individuale di campioni ad ogni pozzo nella piastra da 96 pozzi. Questa metodologia può essere applicata a uno dei diversi campi della ricerca sul microbioma.Prima di iniziare un esperimento, nebuli la panca con il 70% di etanolo. Dopo la pulizia, lasciare asciugare la panchina all'aria prima di spruzzare la panca con il 10% di candeggina. Dopo la pulizia e l'asciugatura ad aria, immergere le forbici chirurgiche microscopulari, spatolari e curve nel 95% di etanolo ed esporre gli strumenti a una fiamma.Quindi immergere ogni utensile in candeggina al 10% e lasciare asciugare all'aria gli utensili. Prima del sotto-campionamento, l'etanolo sterilizza i guanti e omogeneizza accuratamente i campioni di terreno. Assegnare quindi un ID campione con posizione del pozzo a ciascun tubo.Riempire 95 tubi di centrifuga a due millilitri con un campione per tubo, fino a quando ogni tubo è circa mezzo pieno. Il 96° tubo deve essere utilizzato come vuoto di estrazione. Posizionare i tubi del sottocampo sul ghiaccio ed etichettare 96 tubi PCR sterili a cappuccio piatto da 200 microliter in base alle etichette dei pozzi per una piastra da 96 pozzetti, quindi posizionare l'etichetta 200 tubi microliter in ordine in un rack da 96 pozzetti.Per preparare una piastra da 96 po 'per l'esperimento, rimuovere il coperchio dalla piastra e posizionare il coperchio in un sacchetto di plastica sterile. Sigillare il sacchetto per evitare contaminazioni e coprire la piastra con un pezzo pretaglio di pellicola di tenuta perforabile. Quindi utilizzare un rullo di gomma per aderire saldamente alla guarnizione della piastra e conservare la piastra a quattro gradi Celsius.Per trasferire i sottocampi alla piastra, posizionare 24 dei due tubi del sottocampo millilitro in un blocco di ghiaccio per lo stoccaggio a freddo e utilizzare il nome del campione e la scheda di localizzazione del pozzo per selezionare i tubi a chiusura piatta da 200 microlitri appropriati. Vortice i sottocampi uno alla volta, per cinque secondi per campione per garantire l'omogeneizzazione e caricare circa 200 microlitri di ciascun campione nell'appropriato tubo PCR corrispondente. Una volta caricati tutti i 24 campioni, utilizzare una salvietta di carta imbevuta sbiancata per pulire l'esterno di un tubo PCR e invertire e toccare il tubo sulla panca per spostare il campione nella parte superiore del tubo.Utilizzando la fiamma le forbici sterilizzate e sbiancate agganciano il fondo del tubo PCR per creare un'apertura per il campione e passano il tubo sopra la piastra con l'estremità tagliata rivolta verso l'alto fino a raggiungere il pozzo appropriato. Inclinare leggermente la piastra, per facilitare la foratura della pellicola di tenuta foraggibile pretagliata e con il tubo direttamente sopra il pozzo corretto, invertire rapidamente ma con attenzione la piastra in modo che la punta tagliata si adatti al pozzo. Utilizzare uno strumento sterilizzato per toccare la parte superiore del tubo fino a quando tutto il terreno non è caduto dal tubo nel pozzo.E lasciare il tubo nel pozzo con il piombo chiuso. Quando tutti i campioni sono stati caricati nello stesso modo, rimuovere un tubo PCR a punta piatta da 200 microlitri e aggiungere 750 microlitri di soluzione di perline al pozzo del campione. Riposizionare il tubo PCR a punta piatta da 200 microliter nel pozzo spingendolo fino in fondo al pozzo.E usa uno Sharpie per contrassegnare la parte superiore del tubo per indicare che il pozzo è stato caricato. Quando tutti i pozzi sono stati caricati con perline, riportare i 24 tubi campione a 20 gradi Celsius e aggiungere 24 nuovi tubi sottocampo al blocco di ghiaccio, per consentire il caricamento del prossimo set di campioni nella piastra da 96 po 'come appena dimostrato. Quando tutti i 95 dei pozzi sono stati caricati con soluzione di campioni e perline, aggiungere la soluzione di perline solo al 96 ° pozzo.Rimuovere tutti i tubi, passandoli solo sui pozzi coperti e rimuovere con cura la pellicola perforabile dalla piastra. Quindi trasferire con cura il coperchio della piastra dal sacchetto di plastica alla piastra e posizionare la piastra a 20 gradi Celsius fino all'estrazione pianificata. Un confronto dei metodi di caricamento delle lastre mostra che il metodo dimostrato si traduce nella più bassa concentrazione di DNA all'interno dei pozzi vuoti.Usando questo metodo, la concentrazione di DNA era significativamente più bassa quando si utilizzava il metodo proposto da McPherson et al. Sebbene la concentrazione di DNA con questo metodo non fosse statisticamente diversa dal metodo predefinito del qiagen. Tutti e tre i metodi producono concentrazioni medie di DNA sotto due nanogrammi per microlitro.Sebbene solo questo nuovo metodo produca pozzi senza concentrazione misurabile di DNA. Per ridurre al minimo il potenziale di fuoriuscita, mantenere il tubo di 200 microliter in posizione verticale quando lo si sposta sulla piastra, inclinare la piastra e inserire il tubo nel pozzo corretto.

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