Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
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この研究は、NSF賞#EPS-1655726からの資金援助を受けた微生物生態学によって支援されました。

1. 96ウェルプレートを積み込む実験室ベンチと工具の準備
<ol><li>70%エタノールでミストでベンチトップをクリア。拭き取り、空気を乾燥させてから、10%漂白剤でベンチトップをスプレーします。ベンチトップを乾かします。</li>
	<li>95%エタノールに浸漬してマイクロスクラ、ヘラ、手術用ハサミ(湾曲)を殺菌し、炎にさらします。10%漂白剤にそれぞれ浸し、使用前に空気乾燥させます。 注:...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

この方法は、高スループットのサンプル抽出プレートをロードしながら、ウェルツーウェルクロスコンタミネーションの機会を減らし、既存のプレートローディング戦略99,1010を超えて96ウェルプレートをロードするためのより制御された手段を提供する。井戸間の汚染は、特に自動化された66、77の場合?...

微生物群集のハイスループットシーケンシングの最近の進歩は、比類のないシーケンシング深さを提供しており、その結果、地球のマイクロバイオーム1の機能と多様性を前例のない一見に見ることができます。単一のシーケンシングレーンに多重化する能力が増加するにつれて、単一のチューブDNA抽出は、生態学的データの生成におけるレート制限ステップになる可能性を有する。しかし、高スループットDNA抽出における新しい方法は、これまで可能であったよりも効率の良い大量の環境サンプルを処理する約束を保持する2。これらの方法は、多くの場合、単一のチューブの代わりに96ウェルプレートを使用して、同時に発生する可能性のある抽出の数を増加させることが含まれます。このように、高スループット抽出方法の実用性および効率は明らかであり、土壌33、4および4植物組織3、55からヒト便物質2に至るまでの環境試料3の処理のために実施されている。
これらの方法は、サンプル処理とDNA抽出に沿って劇的にスピードアップすることができますが、土壌やその他の生態学的サンプルを96ウェルプレートにロードする最初のステップは、クロスサンプル汚染の影響を受けやすいです。このタイプの井戸汚染は、DNA抽出,6、7、87の6間に発生する可能性があり、サンプルが緩衝溶液に懸濁される前のこの最初のステップでは特に脆弱です。8McPhersonら 9 は、漏斗と 8 ウェル PCR ストリップ カバーを使用して 96 ウェルプレートに根球土壌をロードする方法を示していますが、その方法はプレートのローディングに対するより制御されたアプローチですが、各サンプルをロードする際に隣接するウェルの汚染に十分な機会を提供します。さらに、オープンウェルは、気が散った研究者が誤った井戸にサンプルを入れるか、すでにロードされている井戸にサンプルを追加する機会を可能にします。さらに、さまざまなサンプルタイプがこのメソッドでの読み込みに適さないことを証明しています。湿ったサンプルは、多くの場合、漏斗に固執し、乾燥サンプルは静電気のために井戸間の「ジャンプ」します。
ハイスループットDNA抽出の第1ステップで井戸間の汚染の機会を減らすために、土壌サンプルを96ウェルプレートにロードする新しいアプローチを開発しました。私たちの方法は両方とも環境暴露から井戸を保護し、誤って1つの井戸に複数のサンプルをロードするのを防ぎます(ダブルローディング)。以下に報告されているこの方法は、汚染の可能性を減らすという約束を提供し、その後のDNA抽出のために96ウェルプレートをロードするより制御された手段を提供すると考えています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

高スループットのDNAシーケンシング技術は、微生物群集間の関係、宿主特性、およびより広範な生態系機能の理解の進歩に大きく貢献しています。このシーケンシング能力の急速な増加に伴い、環境DNAを最大限の効率で抽出、増幅、分析、解釈する方法が得られます。残念ながら、DNA抽出を迅速に行うことは、サンプル間の汚染のリスクを高める費用がかかります。特に、96ウェルプレートに含まれるサンプルに基づくハイスループット抽出は、単一チューブ抽出と比較して比較的迅速な方法を提供しますが、ウェル・トゥ・ウェル・クロスコンタミネーションの機会も増加します。サンプル間のクロスコンタミネーションのリスクを最小限に抑えるため、高スループット抽出技術のメリットを維持しながら、環境サンプルを96ウェルプレートにロードする新しい方法を開発しました。サンプルをロードしながら、各プレートをカバーするためにピアス可能なPCRシールフィルムを使用し、サンプルをウェルに移動する前にPCRチューブに最初に追加しました。これらのプラクティスは、サンプルドリフトとウェルの意図しない二重積み込みのリスクを軽減します。本稿で概説した手法は、96ウェルプレートに固有のクロスコンタミネーションのリスクを低減しながら、利用可能なハイスループット抽出技術を最大化するアプローチを研究者に提供します。サンプル採取からDNA抽出への移行方法を、不要なクロスコンタミネーションのリスクを最小限に抑えながら、詳細なステップバイステップの概要を提供します。

この新しい方法は、96ウェルDNA抽出プレートをロードするために正常に使用されました。プレートローディング方法の比較は、ブランクウェル内で最も低いDNA濃度を有する我々の方法を示した。ブランクウェル中のDNA濃度は、私のMcPhersonら (p<0.05)の方法よりも有意に低かったが、我々の方法におけるDNA濃度はQiagenデフォルト法と統計的に異なっていない(図2)?...

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Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

DNA抽出用に96ウェルプレートをロードする現在の方法は、汚染を起こしやすい可能性があります。ウェル間のクロスコンタミネーションのリスクを低減する96ウェルプレートの新しいロード方法を詳しく説明します。当社の方法は、他の研究者が高スループットDNA抽出技術の効率を活用し、汚染のリスクを最小限に抑えるのに役立ちます。

高スループットDNA抽出プレートの装填のための改変方法により、汚染の可能性を低減

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

このプロトコルは、サンプルクロス汚染のリスクを同時に低減しながら、96ウェルDNA抽出プレートのロードの効率を高める技術を提供します。この技術は、96ウェルプレートの各ウェルにサンプルを個々に添加することにより、DNA抽出の重要な第一段階で汚染の可能性を低減します。この方法論は、マイクロバイオーム研究の多様な分野のいずれかに適用することができます。実験を始める前に、70%エタノールでベンチトップをミスト。拭いた後、ベンチに10%漂白剤を吹き付ける前に、ベンチを空気乾燥させます。拭いて空気乾燥した後、マイクロスコキュラー、スパタラー、湾曲した外科用はさみを95%エタノールに浸し、ツールを炎にさらします。その後、各ツールを10%漂白剤に浸し、ツールを空気乾燥させます。サブサンプリングの前に、エタノールは手袋を殺菌し、土壌サンプルを十分に均質化します。次に、各チューブに適切な位置を持つサンプル ID を割り当てます。各チューブが約半分になるまで、チューブごとに1つのサンプルで2ミリリットル遠心管を標識した95を充填します。第96管は抽出ブランクとして使用されるべきである。氷の上にサブサンプルチューブを置き、96ウェルプレートのウェルラベルに従って96無菌200マイクロリットルのフラットキャップPCRチューブにラベルを付け、ラベル200マイクロリットルチューブを96ウェルラックに順番に配置します。実験用に96ウェルプレートを準備するには、プレートからカバーを取り外し、カバーを無菌のビニール袋に入れます。袋を密封して汚染を防ぎ、プレートを穿孔可能なシールフィルムで覆います。その後、ゴムローラーを使用してシールをプレートにしっかりと接着し、プレートを摂氏4度で保存します。サブサンプルをプレートに移すには、2つのミリリットルサブサンプルチューブの24を氷ブロックに入れ、サンプル名とウェル位置シートを使用して、適切な200マイクロリットルのフラットキャップチューブを選択します。サブサンプルを一度に1個ずつ、1サンプルあたり5秒間ボルテックスして均質化を確保し、各サンプルの約200マイクロリットルを適切な対応するPCRチューブにロードします。サンプルの24個すべてがロードされたら、漂白したびれた紙のワイプを使用して1本のPCRチューブの外側を洗浄し、ベンチのチューブを反転してタップしてサンプルをチューブの上部に移動させます。炎の殺菌および漂白されたはさみを使用して、サンプルの開口部を作成するためにPCRチューブの底をクリップし、適切なウェルに達するまでカットエンドを上に向けてプレートの上にチューブを渡します。プレートを少し傾け、切り込み前の密閉フィルムの穿刺を容易にし、チューブを正しい井戸の真上に置き、切った先端がウェルに収まるようにプレートを素早く慎重に反転させます。すべての土壌がチューブから井戸に落ちるまでチューブの上部をタップするために殺菌ツールを使用してください。そして、リードを閉じた状態で井戸にチューブを残します。すべてのサンプルが同じ方法でロードされたら、1つの200マイクロリットルのフラットキャップPCRチューブを取り除き、750マイクロリットルのビーズ溶液をサンプルウェルに加えます。200マイクロリットルのフラットキャップPCRチューブを井戸に戻し、井戸に押し込み、井戸に押し込む。そして、井戸がロードされていることを示すためにチューブの上部をマークするためにシャーピーを使用してください。すべての井戸にビーズが積み込まれるとき24のサンプル管を摂氏20度の貯蔵に戻し、24個の新しいサブサンプルチューブを氷のブロックに加え、次のサンプルセットを96ウェルプレートに積み込むことができます。95個のウェルすべてにサンプルとビーズ溶液がロードされたら、ビーズ溶液を96番目の井戸にのみ追加します。すべてのチューブを取り外し、覆われた井戸の上にのみ渡し、慎重にプレートからピアス可能なフィルムを取り除きます。その後、慎重にビニール袋からプレートにプレートカバーを転送し、計画抽出まで20°Cでプレートを置きます。プレートローディング方法の比較は、実証された方法がブランクウェル内で最も低いDNA濃度をもたらすことを示しています。この方法を用いて、マクファーソンらによって提案された方法を用いた場合、DNA濃度は有意に低かった。この方法によるDNA濃度は、qiagenのデフォルト法と統計的に異なるものではなかった。3つの方法はいずれも、1マイクロリットル当たり2ナノグラム以下の平均DNA濃度を生成する。この新しい方法だけが測定可能なDNA濃度を持たない井戸を作り出すが。こぼれの可能性を最小限に抑えるには、プレート上で200マイクロリットルチューブを直立に保ち、プレートを傾け、チューブを正しいウェルに挿入します。

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

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used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

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アイスキャップ：成長させる方法シロイヌナズナ</emハイスループットジェノタイピング用96ウェルプレートで>とトマト

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Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

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