Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
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이 연구는 NSF 상 #EPS-1655726에서 자금조달과 미생물 생태 협력에 의해 지원되었다.

1. 실험실 벤치 및 96 웰 플레이트를적재딩하기 위한 공구 준비
<ol><li>70%에탄올로 미스티로 벤치 탑을 클리어합니다. 10% 표백제로 벤치 탑을 뿌리기 전에 공기를 닦고 건조시키십시오. 벤치 탑을 말리십시오.</li>
	<li>마이크로 스쿠뮬라, 주걱 및 외과 가위 (곡선)를 95 %에탄올에 담근 다음 화염에 노출하여 살균하십시오. 각 10%의 표백제에 담그고 사용하기 전에 공기 건조를 허용합니다. 참고: 각 ...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

이 방법은 높은 처리량 샘플 추출 플레이트를 적재하는 동안 잘 교차 오염에 대한 기회를 줄이고 기존 플레이트 로딩 전략9,,10을넘어 96 웰 플레이트를 로드하는 보다 제어된 수단을 제공한다. 우물 간의 오염은 단일 튜브 추출보다 96웰 의 플레이트 추출에 더 널리 퍼질 수 있으며, 특히자동화된 6,,7의경우, 어...

미생물 공동체의 고처리량 시퀀싱의 최근 발전은 비교할 수 없는 시퀀싱 깊이를 제공하고 있으며, 결과적으로 지구의 미생물군유전체1의기능과 다양성을 엿볼 수 있습니다. 단일 시퀀싱 레인에 점점 더 많은 샘플을 멀티플렉스하는 능력이 증가함에 따라 단일 튜브 DNA 추출은 생태 데이터 생성에서 속도 제한 단계가 될 가능성이 있습니다. 그러나, 고처리량 DNA 추출의 새로운 방법은 이전에 가능했던 것보다 더 큰 효율을 가진 다량의 환경 샘플을 처리하기위한 약속을보유2. 이러한 방법은 종종 단일 튜브 대신 96 웰 플레이트를 사용하여 동시에 발생할 수있는 추출 수를 증가시키는 것을 포함합니다. 이와 같이, 고처리량 추출 방법의 실용성과 효율이 분명하고 토양3,4 및 식물 조직33,5에서 인간의 배설물물질 2에이르기까지 환경 샘플의 처리를 위해 구현되었다.,
이러한 방법은 시료 처리 및 DNA 추출을 따라 극적으로 속도를 낼 수 있지만 토양 및 기타 생태 샘플을 96웰 플레이트로 적재하는 초기 단계는 교차 시료 오염에 취약합니다. 이러한 유형의 잘 오염은 DNA 추출6,7,7,8동안 발생할 수 있으며, 우물은 이 첫 번째 단계에서 특히 취약하여 샘플이 완충액에서 일시 중단됩니다. McPherson외. 9는 깔때기와 8 웰 PCR 스트립 커버를 사용하여 96 웰 플레이트에 뿌리 권구 토양을 적재하는 방법을 보여 주지만, 그 방법은 플레이트를 적재하는 보다 통제된 접근 방식이지만, 각 시료를 적재할 때 주변 우물의 오염을 위한 충분한 기회를 제공한다. 또한, 오픈 웰은 산만 한 연구원이 잘못된 우물에 샘플을 배치하거나 이미로드 된 우물에 샘플을 추가 할 수있는 기회를 허용합니다. 또한 다양한 샘플 유형이 이 방법으로 로딩에 적합하지 않은 것으로 판명되었습니다. 젖은 샘플은 종종 정전기로 인해 우물 사이에 깔때기와 건조 샘플 '점프'에 충실합니다.
고처리량 DNA 추출의 첫 번째 단계에서 우물 간 오염 기회를 줄이기 위해 토양 샘플을 96웰 플레이트로 적재하는 새로운 접근법을 개발했습니다. 우리의 방법은 모두 환경 노출로부터 우물을 보호하고 실수로 여러 샘플을 하나의 우물 (이중 로딩)에적재하지 못하게합니다. 우리는 아래에 보고된 방법이 오염가능성을 감소시키는 것을 약속하고 그 같은 후속 DNA 추출을 위한 96 웰 플레이트를 적재하는 더 통제된 수단을 제공한다는 것을 믿습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

높은 처리량 DNA 염기서열 분석 기술은 미생물 지역 사회, 호스트 특성 및 광범위한 생태계 기능 간의 관계에 대한 이해의 발전에 실질적으로 기여했습니다. 이러한 급속한 폭과 시퀀싱 기능이 급격히 증가함에 따라 최대 효율로 환경 DNA를 추출, 증폭, 분석 및 해석하는 방법이 왔습니다. 불행히도, DNA 추출을 신속하게 수행하는 것은 샘플 중 오염 위험을 증가시켜야 할 수 있습니다. 특히, 96웰 플레이트에 포함된 샘플을 기반으로 하는 고처리량 추출은 단일 튜브 추출에 비해 비교적 빠른 방법을 제공하지만 잘 교차 오염을 위한 기회도 증가합니다. 시료 간 교차 오염 위험을 최소화하기 위해 고처리량 추출 기술의 이점을 유지하면서 환경 샘플을 96웰 플레이트에 적재하는 새로운 방법을 개발했습니다. 우리는 샘플을로드하는 동안 각 플레이트를 커버하기 위해 피어싱 식 PCR 밀봉 필름을 사용하고 우물로 이동하기 전에 PCR 튜브에 먼저 샘플을 추가했습니다. 이러한 관행은 함께 샘플 드리프트및 의도하지 않은 이중 유정 의 위험을 줄입니다. 이 논문에 설명된 방법은 연구원들에게 96웰 플레이트에 내재된 교차 오염 위험을 줄이면서 사용 가능한 고처리량 추출 기술을 극대화하는 방법을 제공합니다. 우리는 원치 않는 교차 오염의 위험을 최소화하면서 샘플 수집에서 DNA 추출로 이동하는 방법에 대한 자세한 단계를 제공합니다.

이 새로운 방법은 96웰 의 DNA 추출 플레이트를 로드하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 플레이트 로딩 방법의 비교는 빈 우물에서 가장 낮은 DNA 농도를 갖는 우리의 방법을 보여 주었다. 빈 우물의 DNA 농도는 내 맥퍼슨 외9 (p&lt; 0.05)를 제안한 방법보다 현저히 낮았지만, 우리의 방법의 DNA 농도는 Qiagen 기본 방법(도 2)과통계적으로 다르지 않았다. 생성된 세 ...

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Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

DNA 추출을 위한 96웰 플레이트를 적재하는 현재의 방법은 오염되기 쉽습니다. 우리는 우물 중 교차 오염의 위험을 감소 96 웰 플레이트를로드하기위한 새로운 방법을 자세히 설명합니다. 우리의 방법은 다른 연구자들이 고처리량 DNA 추출 기술의 효율성을 활용하고 오염 위험을 최소화하는 데 도움이 될 것입니다.

고처리량 DNA 추출 플레이트의 로딩을 위한 수정된 방법은 오염 가능성을 감소시니다.

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

이 프로토콜은 96웰 DNA 추출 플레이트 로딩의 효율성을 높이는 동시에 시료 교차 오염의 위험을 줄이는 기술을 제공합니다. 이 기술은 96웰 플레이트의 각 우물에 개별적인 샘플을 추가하여 DNA 추출의 중요한 첫 번째 단계 동안 오염 가능성을 감소시킵니다. 이 방법론은 미생물군유전체 연구의 다양한 분야에 적용될 수 있습니다.실험을 시작하기 전에 벤치 탑을 70%에탄올로 미스트합니다. 닦은 후 벤치를 10 % 표백제로 분사하기 전에 벤치를 공기 건조하게하십시오. 닦아 공기 건조 후, 현미경, 경직, 곡선 수술 가위를 95 %에탄올에 찍어 화염에 도구를 노출.그런 다음 각 도구를 10 % 표백제에 담그고 공구가 공기 건조할 수 있도록합니다. 서브 샘플링 전에 에탄올은 장갑을 살균하고 토양 샘플을 철저히 균질화합니다. 다음으로 각 튜브에 위치가 잘 되는 샘플 ID를 할당합니다.각 튜브가 약 반 가득 차날 때까지 튜브 당 하나의 샘플로 95 개의 밀리리터 원심 분리튜브를 채웁니다. 96번째 튜브는 추출 공백으로 사용되어야 합니다. 얼음에 하위 샘플 튜브를 놓고 96 웰 플레이트의 우물 라벨에 따라 96 개의 멸균 200 마이크로 리터 플랫 캡 PCR 튜브를 표시 한 다음 라벨 200 마이크로 리터 튜브를 96 웰 랙에 순서대로 배치합니다.실험을 위해 96웰 플레이트를 준비하려면 플레이트에서 덮개를 제거하고 덮개를 멸균 비닐 봉지에 넣습니다. 오염을 방지하기 위해 가방을 밀봉하고 피어싱 가능한 밀봉 필름의 사전 절단 조각으로 접시를 덮습니다. 그런 다음 고무 롤러를 사용하여 씰을 접시에 단단히 부착하고 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오.서브 샘플을 플레이트로 옮기려면 2밀리리터 서브 샘플 튜브 중 24개를 얼음 블록에 넣고 샘플 이름과 위치 시트를 사용하여 적절한 200 마이크로리터 플랫 캡 튜브를 선택합니다. 소량 샘플을 한 번에 하나씩 소용돌이치며, 샘플당 5초 동안 균질화를 보장하고 각 샘플의 약 200마이크로리터를 적절한 PCR 튜브에 적재합니다. 24개의 샘플이 모두 로드되면 표백된 담근 종이 닦기를 사용하여 하나의 PCR 튜브 의 외부를 청소하고, 반전하고 벤치의 튜브를 탭하여 샘플을 튜브 의 상단으로 이동시합니다.화염 살균 및 표백 가위를 사용하여 PCR 튜브의 바닥을 클립하여 시료에 대한 개구부를 만들고 적절한 우물에 도달 할 때까지 절단 끝이 위로 향하도록 플레이트 위에 튜브를 전달합니다. 플레이트를 약간 기울여 미리 절단가능한 피어싱 가능한 밀봉 필름의 구멍을 용이하게 하고, 튜브를 올바른 우물 바로 위에 넣고, 빠르지만 조심스럽게 플레이트를 반전하여 절단 팁이 잘 들어갑니다. 모든 토양이 튜브에서 우물로 떨어질 때까지 살균 도구를 사용하여 튜브의 상단을 누릅니다.그리고 납이 닫힌 상태로 튜브를 우물에 둡니다. 모든 샘플이 동일한 방식으로 로드된 경우 200마이크로리터 플랫 캡 PCR 튜브 를 제거하고 750 마이크로리터의 비드 용액을 샘플에 잘 추가합니다. 200 마이크로 리터 플랫 캡 PCR 튜브를 우물로 밀어 넣는 우물에 다시 놓습니다.그리고 샤피를 사용하여 튜브의 상단을 표시하여 우물이 로드되었음을 나타냅니다. 모든 우물에 구슬로 적재되면 24개의 샘플 튜브를 섭씨 20도까지 반환하고 24개의 새로운 서브 샘플 튜브를 얼음 블록에 추가하여 다음 샘플 세트를 96웰 플레이트에 적재할 수 있도록 합니다. 모든 95개의 우물에 샘플 및 비드 솔루션이 로드되면 96번째 우물에만 비드 용액을 추가합니다.모든 튜브를 제거하고 덮여 우물 위에만 전달하고 조심스럽게 접시에서 관통 필름을 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 접시 덮개를 비닐 봉지에서 접시로 옮기고 계획된 추출이 될 때까지 접시를 섭씨 20도로 놓습니다. 플레이트 로딩 방법의 비교는 입증된 방법이 빈 우물 내에서 가장 낮은 DNA 농도를 초래한다는 것을 보여줍니다.이 방법을 사용하여, MCPherson 등에서 제안된 방법을 사용할 때 DNA 농도가 현저히 낮았다. 이 방법에 의한 DNA 농도는 카겐 기본 방법과 통계적으로 다르지 않았다. 세 가지 방법 모두 마이크로 리터 당 2 나노 그램 의 DNA 농도를 평균합니다.이 새로운 방법만이 측정 가능한 DNA 농도없이 우물을 생산하지만. 유출 가능성을 최소화하기 위해 플레이트 위로 이동할 때 200 마이크로리터 튜브를 똑바로 세워 놓고 판을 기울여 튜브를 올바른 우물로 삽입하십시오.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

연구

생물학

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

얼음 총액 : 성장을위한 방법 Arabidopsis높은 처리량 Genotyping을위한 96 - 웰 플레이트에와 토마토 식물

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

높은 처리량 응용 프로그램에 대한 성인 Zebrafish의 마음의 복구

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Whitefly에서 Endosymbionts의 추출을위한 방법<em&gt; 베미 시아 타바시</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

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Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

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Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

미세 조류의 모델 개선을 위한 높은 처리량 신진 대사 프로파일링

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