Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Microbial Ecology Collaborative med finansiering fra NSF award #EPS-1655726.

1. Laboratoriebenk og verktøy forberedelse for lasting av en 96-brønns plate
<ol><li>Klar benkeplate ved å tåke med 70% etanol. Tørk av og la luften tørke før du sprayer benkeplate med 10% blekemiddel. Tørk av benketoppen tørr.</li>
	<li>Steriliser mikroskjekuler, slikkepott og kirurgisk saks (buet) ved å dyppe i 95% etanol og deretter utsettes for en flamme. Dypp hver i 10% blekemiddel og la lufttørke før bruk. MERK: Verktøy skal steriliseres mellom hver prøve.</li>
</ol>2. Under...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

Denne metoden reduserer muligheter for godt til godt krysskontaminering ved lasting av høy gjennomstrømningsprøveekstraksjonsplater og tilbyr et mer kontrollert middel for å laste 96-brønnplater utover eksisterende platelastestrategier9,,10. Kontaminering mellom brønner kan være mer gjennomgripende i 96-brønns plateavsug enn i enkeltrørsekstraksjoner, spesielt nårautomatiserte 6,,7, og, men ikke...

Nylige fremskritt innen høy gjennomstrømning sekvensering av mikrobielle samfunn gir enestående sekvensering dybde og følgelig et upretent glimt inn i funksjon og mangfold av jordens mikrobiome1. Etter hvert som muligheten til å multipleks flere og flere prøver på en enkelt sekvensering kjørefelt øker, enkelt rør DNA utvinning har potensial til å bli en hastighetsbegrensende trinn i generering av økologiske data. Nye metoder i DNA-ekstraksjoner med høy gjennomstrømning holder imidlertid løfte om behandling av store mengder miljøprøver med større effektivitet enn det som tidligere har vært mulig2. Disse metodene innebærer ofte å bruke 96-brønnplater i stedet for enkeltrør, og dermed øke mulig antall ekstraksjoner som kan oppstå samtidig. Som sådan er det praktiske og effektiviteten av høy gjennomstrømningsutvinningsmetoder tydelige og har blitt implementert for behandling av miljøprøver som spenner frajord 3,,4 og plantevev3,5 til menneskelig fekal materie2.
Mens disse metodene kan dramatisk øke hastigheten langs prøvebehandling og DNA-ekstraksjon, er det første trinnet med lasting av jord og andre økologiske prøver i 96-brønnplater utsatt for kryssprøvekontaminering. Denne typen brønn-til-brønn-kontaminering kan forekomme under DNA-ekstraksjoner6,,7,,8,og brønner er spesielt sårbare i dette første trinnet før prøvene suspenderes i en bufferløsning. McPherson et al.9 demonstrerer en metode for å laste jordsmonom i 96-brønners plater ved hjelp av trakter og 8-brønns PCR-stripedeksler, men mens metoden er en mer kontrollert tilnærming til lasteplater, gir den fortsatt rikelig mulighet for forurensning av nærliggende brønner ved lasting av hver prøve. I tillegg gir de åpne brønnene muligheten for en distrahert forsker til å plassere en prøve i feil brønn eller legge til en prøve i en brønn som allerede er lastet inn. I tillegg viser en rekke utvalgstyper seg å være dårlig egnet for lasting med denne metoden; våte prøver holder seg ofte til traktene og tørre prøver "hopper" mellom brønner på grunn av statisk elektrisitet.
For å redusere mulighetene for forurensning blant brønner i første trinn av DNA-ekstraksjoner med høy gjennomstrømning utviklet vi en ny tilnærming til lasting av jordprøver i 96-brønnplater. Våre metoder beskytter begge brønner mot miljøeksponering og hindrer oss i å laste flere prøver i en brønn ved et uhell (dobbeltlasting). Vi mener metoden som er rapportert nedenfor, lover å redusere potensialet for forurensning, og gir derfor et mer kontrollert middel for å laste 96-brønnplater for påfølgende DNA-ekstraksjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

Dna-sekvenseringsteknikker med høy gjennomstrømning har bidratt vesentlig til fremskritt i vår forståelse av relasjoner mellom mikrobielle samfunn, vertsegenskaper og bredere økosystemfunksjoner. Med denne raske økningen i bredde og dybde av sekvensering evner har kommet metoder for å trekke ut, forsterke, analysere, og tolke miljø-DNA vellykket med maksimal effektivitet. Dessverre kan utføre DNA-ekstraksjoner raskt komme på bekostning av å øke risikoen for forurensning blant prøver. Spesielt tilbyr høy gjennomstrømningsutvinninger som er basert på prøver i en 96-brønns plate en relativt rask metode, sammenlignet med enkeltrørsekstraksjoner, men også øke mulighetene for godt til brønn krysskontaminering. For å minimere risikoen for krysskontaminering blant prøver, samtidig som vi beholdt fordelene med høy gjennomstrømningsteknikker, utviklet vi en ny metode for lasting av miljøprøver i 96-brønnplater. Vi brukte gjennomborbare PCR-forseglingsfilmer for å dekke hver plate mens vi lastet prøver og la til prøver først til PCR-rør før vi flyttet dem inn i brønner; sammen reduserer disse praksisene risikoen for prøvedrift og utilsiktet dobbel lasting av brønner. Metoden som er skissert i dette papiret gir forskerne en tilnærming til å maksimere tilgjengelige høygjennomstrømningsutvinningsteknikker samtidig som risikoen for krysskontaminering iboende til 96-brønnplater. Vi gir en detaljert trinnvis oversikt over hvordan du går fra prøveinnsamling til DNA-ekstraksjon samtidig som risikoen for uønsket krysskontaminering minimeres.

Denne nye metoden ble brukt med hell til å laste 96-brønns DNA-ekstraksjonsplater. Sammenligning av platelastemetoder viste vår metode for å ha den laveste DNA-konsentrasjonen i de tomme brønnene. DNA-konsentrasjonen i de tomme brønnene var betydelig lavere enn metoden foreslo min McPherson et al.9 (p < 0,05), selv om DNA-konsentrasjoner i vår metode ikke var statistisk forskjellig fra Qiagen standardmetoden (figur 2). Alle tre metodene produserte gjennomsnittl...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Nåværende metoder for lasting av 96-brønnplater for DNA-ekstraksjoner kan være utsatt for forurensning. Vi beskriver en ny metode for lasting av 96-brønnplater som reduserer risikoen for krysskontaminering blant brønner. Vår metode vil hjelpe andre forskere kapitalisere på effektiviteten av høy gjennomstrømning DNA utvinning teknikker og minimere risikoen for forurensning.

Modifiserte metoder for lasting av DNA-ekstraksjonsplater med høy gjennomstrømning reduserer potensialet for kontaminering

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Denne protokollen gir en teknikk for å øke effektiviteten av 96-brønns DNA ekstraksjon plate lasting samtidig redusere risikoen for prøve kryss forurensning. Denne teknikken reduserer sjansene for forurensning under det kritiske første trinnet av DNA-ekstraksjon gjennom individuell tilsetning av prøver til hver brønn i 96-brønnplaten. Denne metodikken kan brukes på noen av de ulike feltene mikrobiomeforskning.Før du begynner et eksperiment, tåke benketoppen med 70% etanol. Etter tørking, la benken lufttørke før du sprayer benken med 10% blekemiddel. Etter tørking og lufttørking dypp mikrokuleringen, spatulær og buet kirurgisk saks i 95% etanol og utsett verktøyene for en flamme.Dypp deretter hvert verktøy i 10% blekemiddel og la verktøyene lufttørke. Før sub-prøvetaking steriliserer etanolhansker og homogeniserer jordprøvene grundig. Deretter tilordner du en prøve-ID med godt plassering til hvert rør.Fyll 95 merket to milliliter sentrifugerør med en prøve per rør, til hvert rør er omtrent halvfullt. 96th tube skal brukes som en ekstraksjon blank. Plasser underprøverørene på is, og legg 96 sterile 200 mikroliter flat-caped PCR rør i henhold til brønnetikettene for en 96-brønns plate, og plasser deretter etiketten 200 mikroliterrør i rekkefølge i et 96-brønnstativ.For å forberede en 96-brønns plate for eksperimentet, fjern dekselet fra platen og legg dekselet i en steril plastpose. Forsegle posen for å hindre kontaminering og dekk platen med et forhåndskuttet stykke pierceable tetningsfilm. Bruk deretter en gummirulle til å feste tetningen fast til platen og oppbevar platen ved fire grader Celsius.Hvis du vil overføre delprøvene til platen, plasserer du 24 av de to milliliter underprøverørene i en isblokk for kald lagring, og bruker prøvenavnet og brønnplasseringsarket til å velge passende tilsvarende 200 mikroliter flate rør. Vortex delprøvene en om gangen, i fem sekunder per prøve for å sikre homogenisering og laste ca 200 mikroliter av hver prøve inn i riktig tilsvarende PCR-rør. Når alle de 24 prøvene er lagt i, bruker du en bleket gjennomvåt papirsletting til å rengjøre utsiden av ett PCR-rør, og snu og trykke på røret på benken for å flytte prøven til toppen av røret.Bruk flammen sterilisert og bleket saks klemme bunnen av PCR-røret for å skape en åpning for prøven, og passere røret over platen med kuttet enden vendt opp til riktig brønn er nådd. Vipp platen litt, for å lette punktering av den forhåndskuttede gjennomborbare forseglingsfilmen, og med røret rett over riktig brønn, raskt, men forsiktig inverter platen slik at den kuttede spissen passer inn i brønnen. Bruk et sterilisert verktøy til å trykke på toppen av røret til all jorda har falt fra røret og inn i brønnen.Og la røret stå i brønnen med ledningen lukket. Når alle prøvene er lastet på samme måte, fjern en 200 mikroliter flat-caped PCR rør og legge til 750 mikroliter perle løsning til prøven godt. Plasser 200 mikroliter flat-caped PCR-røret tilbake i brønnen som skyver det helt ned i brønnen.Og bruk en Sharpie til å markere toppen av røret for å indikere at brønnen er lastet. Når alle brønnene er lastet med perler returnerer de 24 prøverørene til 20 grader Celsius-lagring og legger til 24 nye underprøverør i isblokken, slik at neste sett med prøver lastes inn i 96-brønnplaten som nettopp demonstrert. Når alle 95 brønnene er lastet med prøve- og perleløsning, legg til perleløsning bare til 96th well.Fjern alle rørene, passerer dem bare over overdekkede brønner og fjern forsiktig den gjennomstikkbare filmen fra platen. Overfør deretter platedekselet forsiktig fra plastposen til platen og plasser platen på 20 grader Celsius til den planlagte ekstraksjonen. En sammenligning av platelastemetoder viser at den demonstrerte metoden resulterer i den laveste DNA-konsentrasjonen innenfor de tomme brønnene.Ved hjelp av denne metoden var DNA-konsentrasjonen betydelig lavere da ved bruk av metoden foreslått av McPherson et al. Selv om DNA-konsentrasjonen ved denne metoden ikke var statistisk forskjellig fra qiagens standardmetode. Alle tre metodene, produsere gjennomsnittlige DNA-konsentrasjoner under to nanogram per mikroliter.Selv om bare denne nye metoden produserer brønner uten målbar DNA-konsentrasjon. For å minimere potensialet for søl, hold 200 mikroliterrøret oppreist når du beveger det over platen, vipper platen og setter røret inn i riktig brønn.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for voksende Arabidopsis Og tomatplanter i 96-brønn plater for høy gjennomstrømming Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generasjon av høy kvalitet Chromatin immunoprecipitation DNA Mal for High-throughput sekvensering (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Utvinning av Voksen sebrafisk Hearts for høy gjennomstrømming Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Høy gjennomstrømming Screening for kjemi modulatorer av Post-transcriptionally Regulerte Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Høy throughput CRISPR Vector Konstruksjon og karakterisering av DNA-Modifikasjoner av Generation of Tomato Hårete Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Metoder for utvinning av endosymbionter fra hvitefuglen<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Standardisert metode for høy gjennomstrømming sterilisering av Arabidopsis frø

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Parallell høy gjennomstrømning enkelt molekyl kinetisk analyse for stedsspesifikk DNA cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Metabolsk profilering med høy gjennomstrømning for modellforbedringer av mikroalger

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...