Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
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Esta pesquisa foi apoiada pela Microbial Ecology Collaborative com financiamento do prêmio NSF #EPS-1655726.

1. Banco de laboratório e preparação de ferramentas para carregar uma placa de 96 poços
<ol><li>Banco claro por neblina com 70% de etanol. Limpe e deixe o ar secar antes de pulverizar a parte superior do banco com 10% de alvejante. Limpe a parte de cima do banco seca.</li>
	<li>Esterilizar micro-scoopula, espátula e tesoura cirúrgica (curvada) mergulhando em 95% de etanol e, em seguida, expor a uma chama. Mergulhe cada um em 10% de alvejante e deixe secar o ar antes de usar. NOTA: As ferramentas devem ser este...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

Este método reduz as oportunidades de contaminação cruzada bem--a-bem ao carregar placas de extração de amostras de alto rendimento e oferece um meio mais controlado para carregar placas de 96 poços além das estratégias de carregamento de placas existentes9,,10. A contaminação entre poços pode ser mais difundida em extrações de placas de 96 poços do que em extrações de tubo único, especialmente quando automatizada6,,<...

Os recentes avanços no sequenciamento de alto rendimento das comunidades microbianas estão fornecendo profundidade de sequenciamento sem precedentes e, consequentemente, um vislumbre não precedente do funcionamento e da diversidade do microbioma da Terra1. À medida que a capacidade de multiplex mais e mais amostras em uma única pista de sequenciamento aumenta, a extração de DNA de um único tubo tem o potencial de se tornar um passo limitante na geração de dados ecológicos. No entanto, novos métodos em extrações de DNA de alto rendimento prometem processar grandes quantidades de amostras ambientais com maior eficiência do que já foi possívelanteriormente 2. Esses métodos geralmente envolvem o uso de placas de 96 poços em vez de tubos únicos, aumentando assim o possível número de extrações que podem ocorrer simultaneamente. Assim, a praticidade e eficiência dos métodos de extração de alto rendimento são evidentes e foram implementadas para o processamento de amostras ambientais que vão desde o solo3,,4 e tecidos vegetais3,,5 até a matéria fecal humana2.
Embora esses métodos possam acelerar drasticamente ao longo do processamento de amostras e extração de DNA, a etapa inicial de carregar o solo e outras amostras ecológicas em placas de 96 poços é suscetível à contaminação de amostras cruzadas. Esse tipo de contaminação bem-a-poço pode ocorrer durante as extrações de DNA6,,7,,8, e os poços são particularmente vulneráveis nesta primeira etapa antes que as amostras sejam suspensas em uma solução tampão. McPherson et al.9 demonstram um método para carregar solos de rizosfera em placas de 96 poços usando funis e tampas de tiras PCR de 8 poços, mas embora seu método seja uma abordagem mais controlada para carregar placas, ainda fornece ampla oportunidade para contaminação de poços vizinhos ao carregar cada amostra. Além disso, os poços abertos permitem a chance de um pesquisador distraído colocar uma amostra no poço incorreto ou adicionar uma amostra em um poço que já foi carregado. Além disso, uma variedade de tipos de amostra se mostram inadequados para o carregamento com este método; amostras molhadas muitas vezes grudam nos funis e amostras secas 'saltam' entre poços devido à eletricidade estática.
Para reduzir as oportunidades de contaminação entre os poços na primeira etapa de extrações de DNA de alto rendimento, desenvolvemos uma nova abordagem para carregar amostras de solo em placas de 96 poços. Nossos métodos protegem os poços da exposição ambiental e nos impedem de carregar acidentalmente várias amostras em um poço (carregamento duplo). Acreditamos que o método relatado abaixo oferece a promessa de reduzir o potencial de contaminação e, como tal, fornece um meio mais controlado para carregar placas de 96 poços para extração subsequente de DNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

Técnicas de sequenciamento de DNA de alto rendimento contribuíram substancialmente para avanços na nossa compreensão das relações entre comunidades microbianas, características de hospedagem e funções ecossistêmicas mais amplas. Com esse rápido aumento na amplitude e profundidade das capacidades de sequenciamento vieram métodos para extrair, amplificar, analisar e interpretar o DNA ambiental com sucesso com a máxima eficiência. Infelizmente, a realização de extrações de DNA rapidamente pode vir ao custo de aumentar o risco de contaminação entre as amostras. Em particular, extrações de alto rendimento que são baseadas em amostras contidas em uma placa de 96 poços oferecem um método relativamente rápido, em comparação com extrações de tubo único, mas também aumentam as oportunidades de contaminação cruzada bem-para-bem. Para minimizar o risco de contaminação cruzada entre as amostras, mantendo os benefícios das técnicas de extração de alto rendimento, desenvolvemos um novo método para carregar amostras ambientais em placas de 96 poços. Usamos filmes de vedação PCR perfurantes para cobrir cada placa enquanto carregamos amostras e adicionamos amostras primeiro aos tubos PCR antes de movê-las para poços; juntas, essas práticas reduzem o risco de deriva amostral e carregamento duplo não intencional de poços. O método descrito neste artigo fornece aos pesquisadores uma abordagem para maximizar as técnicas disponíveis de extração de alto rendimento, reduzindo o risco de contaminação cruzada inerente a placas de 96 poços. Fornecemos um esboço detalhado passo a passo de como passar da coleta de amostras para a extração de DNA, minimizando o risco de contaminação cruzada indesejada.

Este novo método foi usado com sucesso para carregar placas de extração de DNA de 96 poços. A comparação dos métodos de carregamento de placas mostrou que nosso método tem a menor concentração de DNA nos poços em branco. A concentração de DNA nos poços em branco foi significativamente menor do que o método proposto pelo meu McPherson et al.9 (p < 0,05), embora as concentrações de DNA em nosso método não fossem estatisticamente diferentes do método padrão de Qiagen<strong class...

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Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Os métodos atuais de carregamento de placas de 96 poços para extrações de DNA podem ser propensos à contaminação. Detalhamos um novo método para carregar placas de 96 poços que reduz o risco de contaminação cruzada entre os poços. Nosso método ajudará outros pesquisadores a capitalizar a eficiência das técnicas de extração de DNA de alto rendimento e minimizar o risco de contaminação.

Métodos modificados para carregamento de placas de extração de DNA de alto rendimento reduzem o potencial de contaminação

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Este protocolo fornece uma técnica para aumentar a eficiência do carregamento da placa de extração de DNA de 96 poços, ao mesmo tempo em que diminui o risco de contaminação cruzada da amostra. Esta técnica reduz as chances de contaminação durante o primeiro passo crítico da extração de DNA através da adição individual de amostras a cada poço na placa de 96 poços. Essa metodologia pode ser aplicada a qualquer um dos diversos campos da pesquisa de microbiomas.Antes de iniciar uma experiência, misture o topo do banco com 70% de etanol. Depois de limpar, deixe o banco secar o ar antes de pulverizar o banco com 10% de alvejante. Depois de limpar e secar o ar, mergulhe a tesoura cirúrgica microscóscular, espápula e curva em 95% de etanol e exponha as ferramentas a uma chama.Em seguida, mergulhe cada ferramenta em 10% de alvejante e deixe as ferramentas secarem ao ar. Antes da subamostragem, o etanol esteriliza luvas e homogeneiza minuciosamente as amostras do solo. Em seguida, atribua um ID de amostra com localização do poço em cada tubo.Encha 95 tubos de centrífugas de mililitro com uma amostra por tubo, até que cada tubo esteja aproximadamente meio cheio. O tubo 96 deve ser usado como um vazio de extração. Coloque os tubos de sub-amostra no gelo, e rotule 96 tubos PCR de tampa plana de 200 microliter de acordo com as etiquetas do poço para uma placa de 96 poços, em seguida, coloque o rótulo de 200 tubos de microliter em ordem em um rack de 96 poços.Para preparar uma placa de 96 poços para o experimento, remova a tampa da placa e coloque a tampa em um saco plástico estéril. Sele o saco para evitar contaminação e cubra a placa com um pedaço pré-cortado de filme de vedação perfurante. Em seguida, use um rolo de borracha para aderir firmemente o selo à placa e armazenar a placa a quatro graus Celsius.Para transferir as subamostras para a placa, coloque 24 dos dois tubos de subamostra mililitro em um bloco de gelo para armazenamento a frio e use o nome da amostra e a folha de localização do poço para selecionar os tubos de tampa plana correspondentes correspondentes. Vórtice subamostra um de cada vez, durante cinco segundos por amostra para garantir a homogeneização e carregar aproximadamente 200 microliters de cada amostra no tubo PCR correspondente apropriado. Quando todas as 24 amostras tiverem sido carregadas, use uma limpeza de papel branqueada para limpar o exterior de um tubo PCR, e inverta e toque o tubo no banco para mover a amostra para a parte superior do tubo.Usando a chama esterilizada e branqueada tesoura clipe a parte inferior do tubo PCR para criar uma abertura para a amostra, e passe o tubo sobre a placa com a extremidade de corte voltada para cima até que o poço apropriado tenha sido atingido. Incline a placa ligeiramente, para facilitar a pontuação do filme de vedação perfurante pré-cortado, e com o tubo diretamente acima do poço correto, rapidamente, mas cuidadosamente inverter a placa para que a ponta de corte se encaixe no poço. Use uma ferramenta esterilizada para tocar a parte superior do tubo até que todo o solo tenha caído do tubo para o poço.E deixe o tubo no poço com a chumbo fechada. Quando todas as amostras tiverem sido carregadas da mesma forma, remova um tubo PCR de tampa plana de 200 microliteres e adicione 750 microliters de solução de contas ao poço da amostra. Coloque o tubo PCR de tampa plana de 200 microliter de volta para o poço empurrando-o todo o caminho para baixo para o poço.E use uma Sharpie para marcar o topo do tubo para indicar que o poço foi carregado. Quando todos os poços tiverem sido carregados com contas, devolva os tubos de amostra de 24 tubos de amostra para 20 graus Celsius de armazenamento e adicione 24 novos tubos de subamostra ao bloco de gelo, para permitir que o próximo conjunto de amostras seja carregado na placa de 96 poços como apenas demonstrado. Quando todos os 95 poços tiverem sido carregados com solução de amostra e contas, adicione a solução de contas apenas ao 96º poço.Remova todos os tubos, passando-os apenas sobre poços cobertos e remova cuidadosamente o filme perfurado da placa. Em seguida, transfira cuidadosamente a tampa da placa do saco plástico para a placa e coloque a placa a 20 graus Celsius até a extração planejada. Uma comparação dos métodos de carregamento de placas mostra que o método demonstrado resulta na menor concentração de DNA dentro dos poços em branco.Usando este método, a concentração de DNA foi significativamente menor do que quando se utilizava o método proposto por McPherson et al. Embora a concentração de DNA por este método não fosse estatisticamente diferente do método padrão qiagen. Todos os três métodos produzem concentrações médias de DNA sob dois nanogramas por microliter.Embora apenas este novo método produz poços sem concentração de DNA mensurável. Para minimizar o potencial de derramamento, mantenha o tubo de 200 microliter ereto ao movê-lo sobre a placa, incline a placa e insira o tubo no poço correto.

Research

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