Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Это исследование было поддержано микробной экологии Сотрудничество с финансированием от NSF награду #EPS-1655726.

1. Лабораторная скамейка и подготовка инструмента для загрузки пластины из 96 колодец
<ol><li>Очистить верхнюю скамейку, затуманив 70% этанола. Протрите и дайте воздуху высохнуть перед распылением скамейке сверху с 10% отбеливателя. Протрите скамейку сверху сухой.</li>
	<li>Стерилизовать микро-sc...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

Этот метод уменьшает возможности для хорошо колодец перекрестного загрязнения при загрузке высокой пропускной способности образца извлечения пластин и предлагает более контролируемые средства для загрузки 96-хорошо пластин за пределами существующих стратегийзагрузки пла?...

Недавние достижения в области секвенирования микробных сообществ с высокой пропускной способностью обеспечивают беспрецедентную глубину секвенирования и, следовательно, беспрецедентный взгляд на функционирование и разнообразие микробиомаЗемли 1. По мере увеличения способности мультиплекса все больше и больше образцов на одну полосу секвенирования, извлечение ДНК одной трубки может стать ограничивающим скорость шагом в генерации экологических данных. Тем не менее, новые методы в высокой пропускной способности ДНК извлечения обещают для обработки больших количеств образцов окружающей среды с большей эффективностью, чем это былоранее возможно 2. Эти методы часто включают в себя использование 96-хорошо пластин вместо однотрубных труб, тем самым увеличивая возможное количество извлечений, которые могут произойти одновременно. Таким образом, практичность и эффективность высокой пропускной способности методов экстракции очевидны и были реализованы для обработки экологическихобразцов,начинаяот почвы 3,4 ирастительных тканей 3,,5 до фекального веществачеловека 2.
Хотя эти методы могут резко ускорить обработку образцов и извлечение ДНК, начальный этап загрузки почвы и других экологических образцов в 96-хорошо пластин подвержены перекрестному загрязнению. Этот тип хорошо загрязнения может произойти во время извлеченияДНК 6,,7,,8 ,и скважиныособенно уязвимы на этом первом этапе, прежде чем образцы приостановлены в буферный раствор. McPherson et al.9 демонстрируют метод загрузки корневища почв в 96-колодец пластин с использованием воронок и 8-хорошо ПЦР полосы охватывает, но в то время как их метод является более контролируемым подходом к погрузке пластин, он по-прежнему предоставляет широкие возможности для загрязнения соседних скважин при загрузке каждого образца. Кроме того, открытые скважины позволяют отвлеченного исследователя поместить образец в неправильную скважину или добавить образец в колодец, который уже был загружен. Кроме того, различные типы образцов оказались неподходят для загрузки с помощью этого метода; влажные образцы часто прилипают к воронки и сухие образцы "прыгать" между скважинами из-за статического электричества.
Чтобы уменьшить возможности загрязнения скважин на первом этапе экстракции ДНК с высокой пропускной способностью, мы разработали новый подход к загрузке образцов почвы в пластины 96 скважин. Наши методы защищают скважины от воздействия окружающей среды и не позволяют нам случайно загрузить несколько образцов в одну скважину (двойная загрузка). Мы считаем, что метод, о которого сообщается ниже, обещает уменьшить потенциал загрязнения и как таковой обеспечивает более контролируемые средства для загрузки 96-хорошо пластин для последующей экстракции ДНК.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

Методы секвенирования ДНК с высокой пропускной способностью в значительной степени способствовали прогрессу в нашем понимании взаимосвязей между микробными сообществами, характеристиками хозяина и более широкими функциями экосистем. При этом быстрое увеличение широты и глубины возможностей секвенирования пришли методы для извлечения, усиления, анализа и интерпретации ДНК окружающей среды успешно с максимальной эффективностью. К сожалению, быстрое выполнение извлечения ДНК может произойти за счет увеличения риска заражения образцов. В частности, экстракции с высокой пропускной способностью, основанные на образцах, содержащихся в пластине 96-й пластины, предлагают относительно быстрый метод, по сравнению с однотрубными извлечениями, но также увеличивают возможности для хорошого перекрестного загрязнения. Чтобы свести к минимуму риск перекрестного загрязнения образцов, сохраняя при этом преимущества высокой пропускной способности методов экстракции, мы разработали новый метод загрузки образцов окружающей среды в 96-колодец пластин. Мы использовали проколочные пленки уплотнения ПЦР для покрытия каждой пластины при загрузке образцов и добавили образцы сначала в ПЦР трубки перед перемещением их в скважины; в совокупности такая практика снижает риск дрейфа проб и непреднамеренной двойной загрузки скважин. Метод, изложенный в настоящем документе, предоставляет исследователям подход к максимальному использованию доступных методов экстракции с высокой пропускной способностью при одновременном снижении риска перекрестного загрязнения, присущего пластинам 96-й пластины. Мы предоставляем подробный шаг за шагом наброски того, как перейти от сбора образцов к извлечению ДНК при минимизации риска нежелательного перекрестного загрязнения.

Этот новый метод был успешно использован для загрузки 96-ну пластины извлечения ДНК. Сравнение методов загрузки пластин показало, что наш метод имеет самую низкую концентрацию ДНК в пустых скважинах. Концентрация ДНК в пустых скважинах была значительно ниже, чем метод предложил мой McPhers...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Современные методы загрузки 96-х пластин для извлечения ДНК могут быть подвержены загрязнению. Мы подробно описали новый метод погрузки пластин 96 скважин, который снижает риск перекрестного загрязнения скважин. Наш метод поможет другим исследователям извлечь выгоду из эффективности высокой пропускной способности методов извлечения ДНК и свести к минимуму риск заражения.

Модифицированные методы загрузки высокой пропускной способности пластин извлечения ДНК снижают потенциал загрязнения

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Этот протокол обеспечивает метод для повышения эффективности 96-ну экстракции ДНК пластины загрузки при одновременном снижении риска перекрестного загрязнения образца. Этот метод снижает шансы на загрязнение на критическом первом этапе извлечения ДНК за счет индивидуального добавления образцов к каждой пластине в пластине 96-колодец. Эта методология может быть применена к любой из различных областей исследований микробиома.Перед началом эксперимента, туман скамейке сверху с 70%этанола. После вытирания, пусть скамейке воздуха сухой, прежде чем распылять скамейке с 10%bleach. После вытирания и сушки воздуха, окунуть микроскопические, шпакулярные и изогнутые хирургические ножницы в 95% этанола и подвергать инструменты пламени.Затем окуните каждый инструмент в 10%отбеливатель и позволить инструментам высушить воздух. Перед подпробами этанол стерилизуют перчатки и тщательно гомогенизируют образцы почвы. Затем назначьте идентификатор образца с расположением хорошо для каждой трубки.Заполните 95 помечены два миллилитровых центрифуг трубки с одним образцом на трубку, пока каждая трубка примерно наполовину заполнены. 96-я трубка должна быть использована в качестве извлечения пустой. Поместите под образец труб на льду, и этикетка 96 стерильных 200 микролитр плоский колпачок ПЦР труб в соответствии с этикетками хорошо для 96-хорошо пластины, а затем поместить этикетку 200 микролитров трубки в порядке в 96-хорошо стойку.Чтобы подготовить к эксперименту пластину из 96 колодец, снимите крышку с тарелки и поместите крышку в стерильный полиэтиленовый пакет. Печать мешок для предотвращения загрязнения и покрыть пластину с предварительно вырезать кусок прокалываемой герметизации пленки. Затем используйте резиновый ролик, чтобы прочно прилипть печать к пластине и хранить пластину при четырех градусах цельсия.Для переноса подтефов на пластину поместите 24 из двух миллилитровых под образец труб в ледяную глыму для холодного хранения, а также используйте название образца и лист расположения хорошо, чтобы выбрать соответствующие 200 микролитровых плоских труб. Вихрь подпроб образцов по одному, в течение пяти секунд на образец для обеспечения гомогенизации и нагрузки около 200 микролитров каждого образца в соответствующую трубку ПЦР. Когда все 24 образца были загружены, используйте отбеленные пропитанной бумаги протрите, чтобы очистить снаружи одной трубки ПЦР, и инвертировать и нажмите трубку на скамейке, чтобы переместить образец в верхней части трубки.Использование пламени стерилизованы и обесцвеченные ножницы клип нижней части трубки ПЦР, чтобы создать отверстие для образца, и пройти трубку над пластиной с разрезом в конце сталкиваются до соответствующего хорошо было достигнуто. Наклоните пластину немного, чтобы облегчить прокол предварительно вырезанной проколоспособной герметизации пленки, и с трубкой непосредственно над правильным хорошо, быстро, но тщательно инвертировать пластину так, что разрез кончик вписывается в колодец. Используйте стерилизованный инструмент, чтобы коснуться верхней части трубки, пока вся почва не упала из трубки в колодец.И оставить трубку в колодец со свинцом закрыты. Когда все образцы были загружены таким же образом, удалите один 200 микролитр плоский ПЦР трубки и добавить 750 микролитров шариков решение образца хорошо. Поместите 200 микролитр плоский крышкой ПЦР трубки обратно в хорошо толкая его всю дорогу вниз в колодец.И используйте Sharpie, чтобы отметить верхнюю часть трубки, чтобы указать, что колодец был загружен. Когда все скважины были загружены бисером вернуть 24 образца труб до 20 градусов по Цельсию хранения и добавить 24 новых под образец труб в ледяной глыбой, чтобы следующий набор образцов, которые будут загружены в 96-ну пластины, как только что продемонстрировали. Когда все 95 скважин будут загружены образцом и раствором бисера, добавьте шариковое решение только к 96-й скважине.Снимите все трубки, передавая их только по крытым колодцам и аккуратно снимите прокалывную пленку с пластины. Затем осторожно перенесите крышку пластины из полиэтиленового пакета на тарелку и поместите пластину при 20 градусах по Цельсию до запланированной добычи. Сравнение методов загрузки пластин показывает, что продемонстрированый метод приводит к наименьшей концентрации ДНК в пустых скважинах.Используя этот метод, концентрация ДНК была значительно ниже, чем при использовании метода, предложенного McPherson et al. Хотя концентрация ДНК по этому методу статистически не отличалась от метода qiagen по умолчанию. Все три метода, производят средние концентрации ДНК под два нанограмма на микролитер.Хотя только этот новый метод производит скважины без измеримой концентрации ДНК. Чтобы свести к минимуму потенциал для разлива, держать 200 микролитров трубки вертикально при перемещении его над пластиной, наклонить пластину и вставить трубку в правильный колодец.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Высокая пропускная способность осахаривания Пробирной для лигноцеллюлозной материалы

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Кап: метод выращивания Arabidopsis И томатов в 96-луночных планшетах для высокопроизводительного генотипирования

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Генерация высших шаблона ДНК хроматина Качество Иммунопреципитация для высокопроизводительного секвенирования (чип-след)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Восстановление взрослых данио сердца для высокой пропускной приложений

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Методы экстракции эндосимбионтов из Белой бабочки<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Стандартный метод стерилизации высок объём Arabidopsis семян

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Параллельная высокая пропускная способность одной молекулы кинетический анализ для сайта-специфического расщепления ДНК

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Высокопроизводительное метаболическое профилирование для уточнения моделей микроросли

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...