Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
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Esta investigación fue apoyada por microbial Ecology Collaborative con financiación del premio NSF #EPS-1655726.

1. Banco de laboratorio y preparación de herramientas para cargar una placa de 96 pozos
<ol><li>Despeje la parte superior del banco al nebar la niebla con el 70% de etanol. Limpie y deje secar al aire antes de rociar la parte superior del banco con 10% de lejía. Limpie la parte superior del banco.</li>
	<li>Esterilice la micro-scoopula, la espátula y las tijeras quirúrgicas (curvadas) sumergiéndose en etanol al 95% y luego exponga a una llama. Sumerja cada uno en 10% de lejía y deje secar al aire antes de usarlo....

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

Este método reduce las oportunidades de contaminación cruzada bien a pozo mientras se cargan placas de extracción de muestras de alto rendimiento y ofrece un medio más controlado para cargar placas de 96 pozos más allá de las estrategias de carga de placas existentes9,,10. La contaminación entre pozos puede ser más generalizada en extracciones de placas de 96 pozos que en extracciones de un solo tubo, especialmente cuando seautomatizan 6...

Los recientes avances en la secuenciación de alto rendimiento de las comunidades microbianas están proporcionando una profundidad de secuenciación sin precedentes y, en consecuencia, una visión poco preciada del funcionamiento y la diversidad del microbioma de la Tierra1. A medida que aumenta la capacidad de multiplexar más y más muestras en un solo carril de secuenciación, la extracción de ADN de un solo tubo tiene el potencial de convertirse en un paso de limitación de velocidad en la generación de datos ecológicos. Sin embargo, los nuevos métodos en extracciones de ADN de alto rendimiento prometen el procesamiento de grandes cantidades de muestras ambientales con mayor eficiencia de la que ha sido posibleanteriormente 2. Estos métodos a menudo implican el uso de placas de 96 pozos en lugar de tubos individuales, aumentando así el número posible de extracciones que pueden ocurrir simultáneamente. Como tal, la practicidad y eficiencia de los métodos de extracción de alto rendimiento son evidentes y se han implementado para el procesamiento de muestras ambientales que van desde el suelo3,4 y los tejidos vegetales3,5 a la materia fecal humana2.
Si bien estos métodos pueden acelerar drásticamente el procesamiento de muestras y la extracción de ADN, el paso inicial de cargar el suelo y otras muestras ecológicas en placas de 96 pozos es susceptible a la contaminación de la muestra cruzada. Este tipo de contaminación a pozo puede ocurrir durante las extracciones de ADN6,7,8, y los pozos son particularmente vulnerables en este primer paso antes de que las muestras se suspenden en una solución tampón. 9 demuestran un9 método para cargar suelos de rizosfera en placas de 96 pozos utilizando embudos y cubiertas de tiras de PCR de 8 pozos, pero si bien su método es un enfoque más controlado para las placas de carga, todavía proporciona una amplia oportunidad para la contaminación de los pozos vecinos al cargar cada muestra. Además, los pozos abiertos permiten la posibilidad de que un investigador distraído coloque una muestra en el pozo incorrecto o agregue una muestra a un pozo que ya se ha cargado. Además, una variedad de tipos de muestras resultan ser poco adecuadas para la carga con este método; las muestras húmedas a menudo se pegan a los embudos y las muestras secas "saltan" entre los pozos debido a la electricidad estática.
Para reducir las oportunidades de contaminación entre pozos en el primer paso de las extracciones de ADN de alto rendimiento, desarrollamos un nuevo enfoque para cargar muestras de suelo en placas de 96 pozos. Nuestros métodos protegen los pozos de la exposición ambiental y nos impiden cargar accidentalmente varias muestras en un pozo (doble carga). Creemos que el método reportado a continuación ofrece la promesa de reducir el potencial de contaminación y como tal proporciona un medio más controlado para cargar placas de 96 pozos para la extracción posterior del ADN.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

Las técnicas de secuenciación de ADN de alto rendimiento han contribuido sustancialmente a los avances en nuestra comprensión de las relaciones entre las comunidades microbianas, las características del huésped y las funciones más amplias del ecosistema. Con este rápido aumento en la amplitud y profundidad de las capacidades de secuenciación han llegado métodos para extraer, amplificar, analizar e interpretar el ADN ambiental con éxito con la máxima eficiencia. Desafortunadamente, realizar extracciones de ADN rápidamente puede venir a costa de aumentar el riesgo de contaminación entre las muestras. En particular, las extracciones de alto rendimiento que se basan en muestras contenidas en una placa de 96 pozos ofrecen un método relativamente rápido, en comparación con las extracciones de un solo tubo, pero también aumentan las oportunidades de contaminación cruzada bien a pozo. Para minimizar el riesgo de contaminación cruzada entre muestras, conservando al mismo tiempo los beneficios de las técnicas de extracción de alto rendimiento, desarrollamos un nuevo método para cargar muestras ambientales en placas de 96 pozos. Usamos películas de sellado de PCR perforables para cubrir cada placa mientras cargamos muestras y agregamos muestras primero a los tubos de PCR antes de moverlas a pozos; juntos, estas prácticas reducen el riesgo de deriva de la muestra y la doble carga no intencionada de pozos. El método descrito en este artículo proporciona a los investigadores un enfoque para maximizar las técnicas de extracción de alto rendimiento disponibles y, al mismo tiempo, reducir el riesgo de contaminación cruzada inherente a las placas de 96 pozos. Proporcionamos un esquema detallado paso a paso de cómo pasar de la recolección de muestras a la extracción de ADN, minimizando al mismo tiempo el riesgo de contaminación cruzada no deseada.

Este novedoso método se utilizó con éxito para cargar placas de extracción de ADN de 96 pozos. La comparación de los métodos de carga de placas mostró que nuestro método tenía la concentración de ADN más baja en los pozos en blanco. La concentración de ADN en los pozos en blanco fue significativamente menor que el método propuesto mi McPherson et al.9 (p < 0.05), aunque las concentraciones de ADN en nuestro método no eran estadísticamente diferentes del método predeterminado Qiagen...

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Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Los métodos actuales para la carga de placas de 96 pozos para extracciones de ADN pueden ser propensos a la contaminación. Detallamos un nuevo método para cargar placas de 96 pozos que reduce el riesgo de contaminación cruzada entre pozos. Nuestro método ayudará a otros investigadores a capitalizar la eficiencia de las técnicas de extracción de ADN de alto rendimiento y minimizar el riesgo de contaminación.

Los métodos modificados para la carga de placas de extracción de ADN de alto rendimiento reducen el potencial de contaminación

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Este protocolo proporciona una técnica para aumentar la eficiencia de la carga de placas de extracción de ADN de 96 pozos, al mismo tiempo que disminuye el riesgo de contaminación cruzada de la muestra. Esta técnica reduce las posibilidades de contaminación durante el primer paso crítico de la extracción de ADN a través de la adición individual de muestras a cada pozo en la placa de 96 pozos. Esta metodología se puede aplicar a cualquiera de los diversos campos de la investigación del microbioma.Antes de comenzar un experimento, neblina la mesa de sobremesa con 70% de etanol. Después de limpiar, deje que el banco se seque al aire antes de rociar el banco con 10%lejía. Después de limpiar y secar al aire, sumerja las tijeras quirúrgicas microscópicas, espátulas y curvas en un 95% de etanol y exponga las herramientas a una llama.A continuación, sumerja cada herramienta en 10% de lejía y deje que las herramientas se sequen al aire. Antes del submuestreo, el etanol esteriliza los guantes y homogeneiza a fondo las muestras del suelo. A continuación, asigne un ID de muestra con la ubicación del pozo a cada tubo.Llene 95 tubos centrífugos de dos mililitros etiquetados con una muestra por tubo, hasta que cada tubo esté aproximadamente medio lleno. El tubo 96 debe utilizarse como una extracción en blanco. Coloque los tubos de submuestra sobre hielo y etiquete 96 tubos de PCR de tapa plana de 200 microlitros estériles de acuerdo con las etiquetas de pozo para una placa de 96 pozos, luego coloque la etiqueta de 200 tubos de microlitro en orden en un bastidor de 96 pozos.Para preparar una placa de 96 pozos para el experimento, retire la cubierta de la placa y coloque la cubierta en una bolsa de plástico estéril. Cierre la bolsa para evitar la contaminación y cubra la placa con una pieza precortado de película de sellado perforable. A continuación, utilice un rodillo de goma para adherir firmemente el sello a la placa y almacene la placa a cuatro grados centígrados.Para transferir las submuestras a la placa, coloque 24 de los dos tubos de submuestra mililitros en un bloque de hielo para almacenamiento en frío, y utilice el nombre de la muestra y la hoja de ubicación del pozo para seleccionar los tubos de techo plano correspondientes a 200 microlitros correspondientes. Vortex las submuestras de una en una, durante cinco segundos por muestra para garantizar la homogeneización y cargar aproximadamente 200 microlitros de cada muestra en el tubo PCR correspondiente apropiado. Cuando se hayan cargado las 24 muestras, utilice una toallita de papel empapada blanqueada para limpiar el exterior de un tubo de PCR, e invierta y toque el tubo en el banco para mover la muestra a la parte superior del tubo.Usando las tijeras esterilizadas y blanqueadas por llama sujetar la parte inferior del tubo PCR para crear una abertura para la muestra, y pasar el tubo sobre la placa con el extremo de corte hacia arriba hasta que se haya alcanzado el pozo apropiado. Incline ligeramente la placa, para facilitar la punción de la película de sellado perforable precortado, y con el tubo directamente por encima del pozo correcto, invierta rápidamente pero cuidadosamente la placa para que la punta cortada encaje en el pozo. Utilice una herramienta esterilizada para tocar la parte superior del tubo hasta que todo el suelo haya caído del tubo hacia el pozo.Y deje el tubo en el pozo con el plomo cerrado. Cuando todas las muestras se hayan cargado de la misma manera, retire un tubo pcR de tapa plana de 200 microlitros y agregue 750 microlitros de solución de perlas al pozo de la muestra. Coloque el tubo PCR de tapa plana de 200 microlitrotro de nuevo en el pozo empujándolo hacia abajo en el pozo.Y usa un Sharpie para marcar la parte superior del tubo para indicar que el pozo ha sido cargado. Cuando todos los pozos se han cargado con cuentas devolver los 24 tubos de muestra a 20 grados Celsius almacenamiento y añadir 24 nuevos tubos de submuestra al bloque de hielo, para permitir que el siguiente conjunto de muestras se cargue en la placa de 96 pozos como acaba de demostrar. Cuando los 95 pozos se han cargado con solución de muestra y perla, añadir solución de cordón sólo a la 96a bien.Retire todos los tubos, pasándolos sólo sobre los pozos cubiertos y retire cuidadosamente la película perforable de la placa. A continuación, transfiera cuidadosamente la cubierta de la placa de la bolsa de plástico a la placa y coloque la placa a 20 grados centígrados hasta la extracción planificada. Una comparación de los métodos de carga de placas muestra que el método demostrado da como resultado la concentración de ADN más baja dentro de los pozos en blanco.Usando este método, la concentración de ADN fue significativamente menor entonces cuando se utiliza el método propuesto por McPherson et al. Aunque la concentración de ADN por este método no era estadísticamente diferente del método predeterminado qiagen. Los tres métodos producen concentraciones medias de ADN bajo dos nanogramos por microlitro.Aunque sólo este nuevo método produce pozos sin concentración de ADN medible. Para minimizar el potencial de derrame, mantenga el tubo de 200 microlitros en posición vertical al moverlo sobre la placa, incline la placa e inserte el tubo en el pozo correcto.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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