Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Bu araştırma Mikrobiyal Ekoloji İşbirliği tarafından NSF ödülü #EPS-1655726 fon ile desteklenmiştir.

1. 96 kuyulu bir plakanın yüklenmesi için laboratuvar tezgahı ve takım hazırlığı
<ol><li>% 70 etanol ile sisleme tarafından tezgah üst temizleyin. % 10 çamaşır suyu ile tezgah üst püskürtme önce silin ve hava kuru izin. Tezgahın üstlerini kurutun.</li>
	<li>Mikro-scoopula sterilize, spatula, ve cerrahi makas (kavisli) daldırma tarafından 95% etanol ve daha sonra bir alev maruz. Her biri %10 çamaşır suyu daldırın ve kullanmadan önce havanın kurumasını bekleyin. NOT: Araçlar her numune ...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

Bu yöntem, yüksek üretim numune çıkarma plakaları yüklerken iyi-to-well çapraz kontaminasyon için fırsatları azaltır ve mevcut plaka yükleme stratejileri 9 ötesinde 96-iyi plakalar yüklemek için daha kontrollü bir araç sunuyor9,10. Kuyular arasında kontaminasyon tek tüp çıkarmalarda daha 96-iyi plaka ekstraksiyon daha yaygın olabilir, özellikle otomatik6,7, ve, herhangi bir metodol...

Mikrobiyal toplulukların yüksek iş bölümü ndeki son gelişmeler benzersiz sıralama derinliği ve sonuç olarak, Dünya'nın mikrobiyom1'inişleyişi ne ve çeşitliliğine emsalsiz bir bakış sağlamaktadır. Tek bir sıralama şeridine daha fazla numune katlandırma yeteneği arttıkça, tek tüpLÜ DNA çıkarma, ekolojik veri üretiminde hız sınırlayıcı bir adım olma potansiyeline sahiptir. Ancak, yüksek verimli DNA ekstraksiyonları yeni yöntemler daha önce mümkün olandan daha fazla verimlilik ile çevresel örneklerin büyük miktarlarda işlenmesi için söz tutun2. Bu yöntemler genellikle tek tüpler yerine 96-iyi plakalar kullanarak, bu nedenle aynı anda oluşabilir ekstraksiyon olası sayısını artırarak içerir. Bu nedenle, yüksek verimli çıkarma yöntemlerinin pratikliği ve verimliliği belirgindir ve toprak3,,4 ve bitki dokularından3,,5'e, insan dışkı madde2'yekadar değişen çevresel örneklerin işlenmesi için uygulanmıştır.
Bu yöntemler numune işleme ve DNA çıkarma boyunca önemli ölçüde hız alabilse de, toprak ve diğer ekolojik numuneleri 96 kuyulu plakalara yüklemenin ilk adımı çapraz numune kontaminasyonuna karşı hassastır. Dna ekstraksiyonu sırasında iyi-to-well kontaminasyon Bu türoluşabilir 6,7,8, ve kuyular örnekler bir tampon çözeltisi askıya önce bu ilk adımda özellikle savunmasızdır. McPherson ve ark.9 huniler ve 8-iyi PCR şerit kapakları kullanarak 96-iyi plakalar içine rizosfer toprak yüklemek için bir yöntem göstermek, ancak onların yöntemi yükleme plakaları için daha kontrollü bir yaklaşım olsa da, hala her örnek yükleme komşu kuyuların kirlenmesi için yeterli fırsat sağlar. Ayrıca, açık kuyular, dikkati dağılmış bir araştırmacının yanlış kuyuya bir örnek yerleştirmesine veya zaten yüklenmiş bir kuyuya numune eklemesine olanak sağlar. Buna ek olarak, çeşitli örnek türleri bu yöntemle yükleme için uygun olmadığını kanıtlamaktadır; ıslak numuneler genellikle hunilere yapışır ve kuru numuneler statik elektrik nedeniyle kuyular arasında 'atlatır'.
Yüksek iş türündeki DNA çıkarmalarının ilk adımında kuyular arasında kontaminasyon olanaklarını azaltmak için, toprak örneklerini 96 kuyulu plakalara yüklemek için yeni bir yaklaşım geliştirdik. Yöntemlerimiz hem kuyuları çevreye maruz kalmaktan korur hem de yanlışlıkla birden fazla numuneyi tek bir kuyuya yüklememizi engeller (çift yükleme). Aşağıda bildirilen yöntemin kontaminasyon potansiyelini azaltma sözü verdiğine ve bu nedenle sonraki DNA ekstraksiyonu için 96 kuyuluk plakaları yüklemek için daha kontrollü bir araç sağladığına inanıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

Yüksek verimli DNA dizileme teknikleri mikrobiyal topluluklar, ev sahibi özellikleri ve daha geniş ekosistem fonksiyonları arasındaki ilişkileri anlamamızda önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Genişlik ve sıralama yetenekleri derinliği bu hızlı artış ile ayıklamak için yöntemler geldi, yükseltmek, analiz etmek, ve maksimum verimlilik ile başarılı bir şekilde çevresel DNA yorumlamak. Ne yazık ki, hızlı bir şekilde DNA çıkarma gerçekleştirme örnekleri arasında kontaminasyon riskini artırma pahasına gelebilir. Özellikle, 96 kuyulu bir plakada bulunan numunelere dayanan yüksek iş çıkarmalar, tek tüplü ekstraksiyonlara kıyasla nispeten hızlı bir yöntem sunmakla birlikte, iyiye çapraz kontaminasyon olanaklarını da artırır. Numuneler arasında çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için, yüksek iş hacmi çıkarma tekniklerinin avantajlarını korurken, çevresel numuneleri 96 kuyulu plakalara yüklemek için yeni bir yöntem geliştirdik. Numuneleri yüklerken her plakayı kapsayacak şekilde delilebilir PCR sızdırmazlık filmlerini kullandık ve numuneleri kuyulara taşımadan önce PCR tüplere ekledik; birlikte, bu uygulamalar örnek sürüklenme ve kuyuların istenmeyen çift yükleme riskini azaltır. Bu makalede özetlenen yöntem, araştırmacılara mevcut yüksek iş gücü çıkarma tekniklerini en üst düzeye çıkarma yaklaşımı sağlarken, 96 kuyulu plakalara doğal çapraz kontaminasyon riskini de azaltır. İstenmeyen çapraz kontaminasyon riskini en aza indirirken örnek toplamadan DNA çıkarmasına nasıl geçebileceğimize dair adım adım ayrıntılı bir adım sayılmayı sağlıyoruz.

Bu yeni yöntem 96 kuyulu DNA çıkarma plakalarını yüklemek için başarıyla kullanılmıştır. Plaka yükleme yöntemlerinin karşılaştırılması, metoduzun boş kuyularda en düşük DNA konsantrasyonuna sahip olduğunu gösterdi. Boş kuyularda DNA konsantrasyonu benim McPherson et al.9 (p < 0.05) önerilen yöntemden önemli ölçüde daha düşüktü, ancak yöntemimizdeki DNA konsantrasyonları istatistiksel olarak Qiagen varsayılan yönteminden istatistiksel olarak farklı değild...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

DNA ekstraksiyonları için 96 kuyulu plakayükleme için mevcut yöntemler kontaminasyona yatkın olabilir. Kuyular arasında çapraz kontaminasyon riskini azaltan 96 kuyulu plakaların yüklenmesi için yeni bir yöntem ayrıntılı olarak inceleniyoruz. Yöntemimiz, diğer araştırmacıların yüksek verimli DNA çıkarma tekniklerinin verimliliğinden yararlanmalarına ve kontaminasyon riskini en aza indirmelerine yardımcı olacaktır.

Yüksek İşlemli DNA Çıkarma Plakalarının Yüklenmesinde Modifiye Yöntemler Kontaminasyon Potansiyelini Azaltır

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Bu protokol, aynı anda numune çapraz kontaminasyon riskini azaltırken 96 kuyulu DNA ekstraksiyon plakayükleme verimliliğini artırmak için bir teknik sağlar. Bu teknik, 96 kuyulu plakadaki her kuyuya numunelerin ayrı ayrı eklenmesi yle DNA çıkarmanın kritik ilk adımısırasında kontaminasyon olasılığını azaltır. Bu metodoloji mikrobiyom araştırmalarının çeşitli alanlarından herhangi biri için uygulanabilir.Bir deneye başlamadan önce, %70 etanol ile tezgahın üstünü sisle. Sildikten sonra, tezgaha %10 çamaşır suyu püskürtmeden önce tezgahın havayla kurumasına izin verin. Silme ve hava kurutma sonra, mikroskopular, spatular ve kavisli cerrahi makas daldırma 95% etanol içine ve bir alev aletleri maruz.Daha sonra her aleti %10 çamaşır suyuna batırın ve aletlerin kurumasını bekleyin. Alt örneklemeden önce, etanol eldivenleri sterilize eder ve toprak örneklerini iyice homojenize eder. Sonraki her tüp için iyi bir konuma sahip bir örnek kimlik atayın.Her tüp yaklaşık yarı dolu olana kadar, tüp başına bir örnek ile 95 etiketli iki mililitre centrifuge tüpler doldurun. 96. tüp bir ekstraksiyon boş olarak kullanılmalıdır. Alt numune tüplerini buzüzerine yerleştirin ve 96 steril 200 mikrolitre düz kapaklı PCR tüplerini 96 kuyulu bir plaka için kuyu etiketlerine göre etiketlendirin, ardından etiket 200 mikrolitre lik tüpleri 96 kuyulu bir rafa yerleştirin.Deney için 96 kuyuluk bir plaka hazırlamak için kapağı tabaktan çıkarın ve kapağı steril plastik bir torbaya yerleştirin. Kontaminasyonu önlemek için torbayı kapatın ve plakayı önceden kesilmiş bir delinebilir sızdırmazlık filmi ile kaplayın. Daha sonra mührü sıkıca tabağa yapıştırmak ve plakayı dört santigrat derecede saklamak için kauçuk bir rulo kullanın.Alt numuneleri tabağa aktarmak için, iki mililitrelik alt numune tüplerinden 24'ünü soğuk depolama için bir buz bloğuna yerleştirin ve uygun karşılık gelen 200 mikrolitrelik düz kapaklı tüpleri seçmek için örnek adı ve iyi konum sayfasını kullanın. Homojenizasyon sağlamak ve her numunenin yaklaşık 200 mikrolitresini uygun pcr tüpüne yüklemek için alt numuneleri birer, numune başına beş saniye boyunca girdaplayın. Örneklerin 24'ünün tamamı yüklendiğinde, bir PCR tüpünün dışını temizlemek için ağartılmış bir kağıt mendil kullanın ve numuneyi tüpün tepesine taşımak için tezgahtaki tüpü ters çevirin ve dokunun.Alev sterilize ve ağartılmış makas kullanarak pcr tüpünün alt kısmını kesilerek numune için bir açıklık oluşturun ve tüpü, uygun kuyuya ulaşılıncaya kadar kesip plakanın üzerinden geçirin. Önceden kesilebilir sızdırmazlık filminin delinmesini kolaylaştırmak için plakayı hafifçe yatırın ve boru doğrudan doğru kuyunun üzerinde, hızlı ama dikkatlice plakayı ters çevirerek kesme ucunun kuyuya sığmasını sağlar. Tüm toprak tüpten kuyuya düşene kadar tüpün üst dokunun için sterilize bir alet kullanın.Ve boruyu kuyuda kurşun kapalı bırak. Tüm numuneler aynı şekilde yüklendiğinde, bir 200 mikrolitre düz kapaklı PCR tüp çıkarın ve numuneye iyi bir şekilde 750 mikrolitre boncuk çözeltisi ekleyin. 200 mikrolitredüz kapaklı PCR tüpünü kuyuya geri yerleştirin.Ve kuyunun yüklendiğini göstermek için tüpün üstünü işaretlemek için bir Sharpie kullanın. Tüm kuyular boncuklarla yüklendiğinde 24 numune tüpünü 20 santigrat derece depolamaya geri döndürün ve bir sonraki numune setinin 96 kuyulu plakaya yüklenmesi için buz bloğuna 24 yeni alt numune tüpü ekleyin. Kuyuların 95'inin tamamı numune ve boncuk çözeltisi ile yüklendiğinde, sadece 96.Sadece kapalı kuyuların üzerinden geçirerek tüm tüpleri çıkarın ve dikkatlice plakadan delinebilir film kaldırın. Daha sonra plaka kapağını plastik torbadan plakaya dikkatlice aktarın ve plakayı planlanan ekstraksiyona kadar 20 derecede yerleştirin. Plaka yükleme yöntemlerinin karşılaştırılması, gösterilen yöntemin boş kuyular içindeki en düşük DNA konsantrasyonu ile sonuçverdiğini göstermektedir.Bu yöntem kullanılarak McPherson ve arkadaşlarının önerdiği yöntemi kullanırken DNA konsantrasyonu önemli ölçüde daha düşüktü. Bu yöntemle DNA konsantrasyonu istatistiksel olarak qiagen varsayılan yönteminden farklı olmasa da. Her üç yöntem de, mikrolitre başına iki nanogram altında ortalama DNA konsantrasyonları üretir.Sadece bu yeni yöntem hiçbir ölçülebilir DNA konsantrasyonu ile kuyular üretir rağmen. Dökülme potansiyelini en aza indirmek için, 200 mikrolitrelik tüpü plakanın üzerinde hareket ettirirken dik tutun, plakayı yatırın ve tüpü doğru kuyuya takın.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: Büyüyen Bir Yöntem Arabidopsis</emYüksek Verim Genotiplendirme için 96-iyi Tabaklar ve Domates Tesisleri>

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Yüksek verim Uygulamaları Yetişkin Zebra Hearts Kurtarma

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Beyaz sinekten Endosimbonların Çıkarılması İçin Yöntemler<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Yüksek işlem hacmi sterilizasyon Arabidopsis tohum için standart yöntem

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Mikroalglerin Model İyileştirmeleri için Yüksek Verimli Metabolik Profil oluşturma

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...