Name: transverse sectioning of mature rice (oryza sativa l.) kernels for scanning electron microscopy imaging using pipette tips as immobilization support
Uploaded: 2022-01-25T13:00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support at JoVE.com

authors ممتنون لأنظمة للبحوث (SFR كورب) لاستخدامها فينوم ProX سطح المكتب SEM الصك ، وكذلك للمساعدة التقنية التي تقدمها ماريا Pilarinos (نظم البحوث (SFR) كورب) وكلوي فان Oostende - الثلاثي (بيولوجيا الخلية والحصول على صورة مرفق الأساسية ، كلية الطب ، جامعة أوتاوا). تم توفير التمويل من قبل صندوق الابتكار منخفض الكربون (LCIF) من وزارة التنمية الاقتصادية وخلق فرص العمل والتجارة في حكومة أونتاريو، وشركة البروتينات السهلة.

1. إعداد مقطع الأرز المستعرض
<ol><li>دي قشر الجافة، حبات سليمة كما هو مبين في الشكل 1A.<ol>
<li>تخفيف قشور وحبات الأرز dehull عن طريق طحن حبات بين اثنين من سدادات المطاط شقة. إزالة حبات الأرز أجش من panicle، إذا لزم الأمر.</li>
		<li>ضع نواة واحدة على سدادة مطاطية مسطحة على مقعد العمل (الشكل 1B). تأكد من أن هذه السدادة لا تزال ثابتة.</li>
		<li>استخدام سدادة المطاط المسطح الثاني (الشكل 1C) لتآكل النواة عن طريق التواء في مقابل سدادة المطاط الأول، وذلك باستخدام ضغط كاف(الشكل 1D). إزالة قشور من النواة، مع الحرص على عدم تحطيم الاندوسبيرم. إزالة أي قشر المتبقية باستخدام ملقط غرامة. تظهر نواة مقشورة في الشكل 1E.</li>
	</ol>
</li>
	<li>باستخدام ملقط ناعم، أدخل نواة فردية متقشرة في طرف ماصة بلاستيكي (حجم 250 ميكرولتر، بذرة واحدة/طرف واحد)(الشكل 1F). تأكد من أن نهاية الجنين من النواة تواجه نحو نهاية (مخروطية) من طرف ماصة(الشكل 1G). ملاحظة: إدراج النواة بهذه الطريقة يضمن أن النواة سوف تناسب بشكل مريح قدر الإمكان في تلميح ماصة كما النواة أضيق نحو نهايتها القريبة.</li>
	<li>إدراج طرف ماصة 250 ميكرولتر الثانية لإجبار النواة في طرف ماصة والحفاظ على نواة غير متحركة أثناء تقسيم، مع الحرص على عدم تلف النواة أو ثني تلميح ماصة الثانية (الشكل 1H). يشار إلى تجميع "التلسكوب" المناسب في الشكل 1I.</li>
	<li>وضع ماصة طرف تجميع شقة على مقاعد البدلاء العمل وعقد في مكان باليد (الشكل 1J). من ناحية أخرى، استخدم شفرة مشرط حادة (رقم 20) لشريحة من خلال وسط النواة وقطع نهاية تلميح ماصة قبالة(الشكل 1K). باستخدام مشرط قطع 1 مم أقسام سميكة من نواة الأرز (الشكل 1L). ملاحظة: يتم إحاطة قسم النواة بإحكام داخل أنولوس من البلاستيك(الشكل 1M). تم العثور على متوسط سمك المقطع لثلاثة أنماط جينية مثالية في الجدول 1. أقسام أرق بكثير من 1 مم سوف تتحطم أو تنهار. من المهم أن نلاحظ من أي جزء من النواة كل قسم ينبع إذا كان يجري تنفيذ هذه التجربة على عدة أصناف من الأرز للمقارنة، كما مورفولوجيا النشا لا تختلف في جميع أنحاء11endosperm .</li>
</ol>2. المجهر الضوء المنعكس من أقسام الأرز العرضي
<ol><li>استخدم ملقط دقيق لوضع أقسام الأرز المستعرض (المعدة في القسم 1) على قطعة سوداء من الورق الأسود الثقيل.</li>
	<li>الحصول على صور ضوئية من أقسام عرضية من نيبونباري باستخدام مجسم مع goosenecks شنت للإضاءة المائلة، كما هو مبين في الشكل 1N-S.</li>
	<li>مراقبة مورفولوجيا المناظير تحت التكبير 10x على الأقل. ملاحظة: أي مصدر ضوء أفضل من المجهر حقل مشرق كما المقاطع التي تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنية ليست رقيقة بما يكفي للضوء لتمرير من خلال.</li>
</ol>3. المسح المجهري الإلكتروني من أقسام الأرز العرضي
<ol><li>ضع العينات على قرص كربوني ملتصق بكعب الألومنيوم وضع على حامل عينة تقليل الشحنة. إزالة حلقة من البلاستيك من جبل تلميح ماصة باستخدام ملقط ناعم لمنع البلاستيك من دخول جهاز فراغ من SEM. ملاحظة: يتم الحصول على صور خلايا endosperm وSGs و subgranules باستخدام جهاز سطح المكتب SEM لا يتطلب عينات لتكون مغلفة.</li>
	<li>الحصول على الصور باستخدام عالية الحساسية متعددة وضع جهاز الكشف عن الإلكترون (BSE) في 10 كيلو فولت.</li>
</ol>

<ol>
	<li>James, M. G., Denyer, K., Myers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch+synthesis+in+the+cereal+endosperm.">Starch synthesis in the cereal endosperm.</a> Current Opinion in Plant Biology. 6 (3), 215-222 (2003).</li><li>Shapter, F. M., Henry, R. J., Lee, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosperm+and+starch+granule+morphology+in+wild+cereal+relatives.">Endosperm and starch granule morphology in wild cereal relatives.</a> Plant Genetic Resources. 6 (2), 85-97 (2008).</li><li>Ashida, K., Iida, S., Yasui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological,+physical,+and+chemical+properties+of+grain+and+flour+from+chalky+rice+mutants.">Morphological, physical, and chemical properties of grain and flour from chalky rice mutants.</a> Cereal Chemistry. 86 (2), 225-231 (2009).</li><li>Matsushima, R., Maekawa, M., Fujita, N., Sakamoto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+direct+observation+method+to+isolate+mutants+with+defects+in+starch+grain+morphology+in+rice.">A rapid, direct observation method to isolate mutants with defects in starch grain morphology in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 728-741 (2010).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stable+QTLs+causing+chalk+in+rice+grains+in+nine+environments.">Identification of stable QTLs causing chalk in rice grains in nine environments.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (1), 141-153 (2016).</li><li>Nagato, K., Ebata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high+temperature+during+ripening+period+on+the+development+and+the+quality+of+rice+kernels.">Effects of high temperature during ripening period on the development and the quality of rice kernels.</a> Japanese Journal of Crop Science. 34 (1), 59-66 (1965).</li><li>Zhao, X., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+change:+implications+for+the+yield+of+edible+rice.">Climate change: implications for the yield of edible rice.</a> PLoS One. 8 (6), 66218 (2013).</li><li>Zhao, Z. K., Mu, T. H., Zhang, M., Richel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high+hydrostatic+pressure+and+microbial+transglutaminase+treatment+on+structure+and+gelation+properties+of+sweet+potato+protein.">Effects of high hydrostatic pressure and microbial transglutaminase treatment on structure and gelation properties of sweet potato protein.</a> LWT - Food Science and Technology. 115, 108436 (2019).</li><li>Feiz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puroindolines+co-localize+to+the+starch+granule+surface+and+increase+seed+bound+polar+lipid+content.">Puroindolines co-localize to the starch granule surface and increase seed bound polar lipid content.</a> Journal of Cereal Science. 50 (1), 91-98 (2009).</li><li>Zhao, L., Pan, T., Guo, D., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+preparing+the+whole+section+of+starchy+seed+to+investigate+the+morphology+and+distribution+of+starch+in+different+regions+of+seed.">A simple and rapid method for preparing the whole section of starchy seed to investigate the morphology and distribution of starch in different regions of seed.</a> Plant Methods. 14 (1), 16 (2018).</li><li>Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+whole+sections+of+mature+cereal+seeds+to+visualize+the+morphology+of+endosperm+cell+and+starch+and+the+distribution+of+storage+protein.">Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein.</a> Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).</li><li>Li, C., Dong, S., Li, G., Yuan, G., Dong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+and+application+of+the+new+combination+of+hybrid+rice+"Xieyou+7954".">Breeding and application of the new combination of hybrid rice "Xieyou 7954".</a> Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences). 19 (3), 179-181 (2002).</li><li>Shu, X., Jia, L., Ye, H., Li, C., Wu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+digestion+properties+of+rice+different+in+resistant+starch.">Slow digestion properties of rice different in resistant starch.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (16), 7552-7559 (2009).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+soluble+starch+synthase+SSIIIa+and+granule-bound+starch+synthase+Waxy+in+synthesizing+resistant+starch+in+rice.">Critical roles of soluble starch synthase SSIIIa and granule-bound starch synthase Waxy in synthesizing resistant starch in rice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (45), 12844-12849 (2016).</li><li>Yang, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch+properties+of+mutant+rice+high+in+resistant+starch.">Starch properties of mutant rice high in resistant starch.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, 523-528 (2006).</li><li>Zhou, Y., Zou, Y., Jiang, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+methods+for+resistance+starch+content+of+Yi-Tang+rice+and+optimization+of+pretreatment.">Detection methods for resistance starch content of Yi-Tang rice and optimization of pretreatment.</a> Food Science and Biotechnology. 36, 416-419 (2017).</li><li>Cheng, X., Sardana, R., Kaplan, H., Altosaar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-transformed+rice+plants+expressing+synthetic+cryIA(b)+and+cryIA(c)+genes+are+highly+toxic+to+striped+stem+borer+and+yellow+stem+borer.">Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2767-2772 (1998).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+P-35S+and+T-nos+in+genetically+modified+organisms+by+recombinase+polymerase+amplification+combined+with+a+lateral+flow+strip.">Rapid detection of P-35S and T-nos in genetically modified organisms by recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow strip.</a> Food Control. 107, 106775 (2020).</li><li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rice+plants+with+a+synthetic+cry1Ab+gene+from+Bacillus+thuringiensis+were+highly+resistant+to+eight+lepidopteran+rice+pest+species.">Transgenic rice plants with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis were highly resistant to eight lepidopteran rice pest species.</a> Molecular Breeding. 6 (4), 433-439 (2000).</li><li>Lisle, A. J., Martin, M., Fitzgerald, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chalky+and+translucent+rice+grains+differ+in+starch+composition+and+structure+and+cooking+properties.">Chalky and translucent rice grains differ in starch composition and structure and cooking properties.</a> Cereal Chemistry. 77 (5), 627-632 (2000).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+starch+granules+and+the+regulation+of+starch+biosynthesis+in+Brachypodium+distachyon:+comparison+with+common+wheat+and+Aegilops+peregrina.">Dynamic development of starch granules and the regulation of starch biosynthesis in Brachypodium distachyon: comparison with common wheat and Aegilops peregrina.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 198 (2014).</li><li>Giroux, M. J., Morris, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+grain+hardness+results+from+highly+conserved+mutations+in+the+friabilin+components+puroindoline+a+and+b.">Wheat grain hardness results from highly conserved mutations in the friabilin components puroindoline a and b.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6262-6266 (1998).</li><li>Matsushima, R., Hisano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+amyloplasts+in+the+developing+endosperm+of+barley+and+rice.">Imaging amyloplasts in the developing endosperm of barley and rice.</a> Scientific Reports. 9, 3745 (2019).</li><li>Matsushima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloplast-localized+SUBSTANDARD+STARCH+GRAIN4+protein+influences+the+size+of+starch+grains+in+rice+endosperm.">Amyloplast-localized SUBSTANDARD STARCH GRAIN4 protein influences the size of starch grains in rice endosperm.</a> Plant Physiology. 164 (2), 623-636 (2014).</li><li>Monjardino, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+flange+and+reticulate+wall+ingrowths+in+maize+(Zea+mays+L.)+endosperm+transfer+cells.">Development of flange and reticulate wall ingrowths in maize (Zea mays L.) endosperm transfer cells.</a> Protoplasma. 250 (2), 495-503 (2013).</li><li>Tizro, P., Choi, C., Khanlou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+transmission+electron+microscopy.">Sample preparation for transmission electron microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 417-424 (2019).</li><li>Liu, Q. H., Zhou, X. B., Yang, L. Q., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chalkiness+on+cooking,+eating+and+nutritional+qualities+of+rice+in+two+indica+varieties.">Effects of chalkiness on cooking, eating and nutritional qualities of rice in two indica varieties.</a> Rice Science. 16 (2), 161-164 (2009).</li><li>Morita, S., Wada, H., Matsue, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures+for+heat+damage+in+rice+grain+quality+under+climate+change.">Countermeasures for heat damage in rice grain quality under climate change.</a> Plant Production Science. 19 (1), 1-11 (2016).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

تمثل التقنية المعروضة هنا نهجا سريعا وبسيطا وحريصا نحو إعداد مقاطع عرضية من الأرز لتصور SEM على سطح المكتب. تسمح تقنية الأقسام هذه بالملاحظة السريعة لهيكل الاندوسبيرم وشكل الخلية الداخلية والحجم والنمط وحبيبات المركب ومورفولوجيا النشا. لأغراض الفينوتيبينج إندوسبيرم وفحص الجرثومة، فمن الأهمية بمكان الحصول على مقطع عرضي كامل من نواة الأرز4،23،24. من الأهمية بمكان إدراج النواة بالكامل داخل طرف ماصة لمنع ضغط شفرة المشرط من إجبار الاندوسبيرم على الانهيار أو التحطم. شريطة أن يتم بناء تجميع "التلسكوب" بشكل صحيح ، يمكن إعداد العينات للتصور في غضون 15 ثانية(الجدول 2)باستخدام المواد الموجودة بالفعل في إعداد مختبر نموذجي. وتنطبق هذه التقنية على المقطع العرضي لأي بذرة بيضاوية قطرها حوالي أربعة ملليمترات في أوسع نقطة لها. بذور العشب نموذج Brachypodium distachyon (الشكل S2A) يمكن تقسيمها بالمثل ولكن لا تبقى مغلقة داخل annulus. بذور أكبر، مثل القمح، كسر بسهولة وتتطلب الرعاية عند تقسيم (الشكل S2B).
ومع ذلك ، هناك العديد من القيود على هذه التقنية المعروضة هنا. المقاطع التي تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنية ليست رقيقة بما يكفي للضوء لتمرير من خلالها الذي يحظر استخدام هذه التقنية للنهج المجهرية المرسلة على أساس الضوء مثل حقل مشرق (500 ميكرومتر سمك العينة القصوى لأقسام نواة الأرز25) ونقل المجهر الإلكتروني (TEM) (500 نانومتر سمك العينة القصوى26 ). استخدام طرف ماصة كما "مصفوفة" المقطع يحد أيضا من حجم البذور التي يمكن تقسيمها باستخدام هذه التقنية. وستكون هناك حاجة إلى مزيد من استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتكييف هذه التقنية للأنواع التي تختلف كثيرا عن الأرز، ويقتصر حجم "المصفوفة" على حجم نصائح ماصة المتاحة للشراء.
ميزة أخرى متميزة أن هذه التقنية يوفر هو نوعية العينات التي يمكن أن تنتج من حبات الأرز النمط الظاهري طباشيري. تجدر الإشارة إلى أنه حتى دراسة ماتسوشيما أقرت بأنه كان من الصعب الحصول على مقاطع عرضية باستخدام هذه الطريقة الخاصة للأنماط الظاهرية الطباشيرية4، كما تكررت في هذه الدراسة لغرض المقارنة(الشكل 1S). في حالتهم ، أصبح من الضروري إصلاح عينات الأرز الطباشيري الخاصة بهم كيميائيا وتضمينها في الراتنج للقسم. تقنية جديدة، جنبا إلى جنب مع التصوير SEM سطح المكتب، يسمح للباحث لإعداد بسهولة أقسام عرضية من حبات الأرز للفحص المجهري مع مزيد من الاتساق من دون دعم شل الحركة(الجدول 3).
في العصر الجديد من علم وظائف الأعضاء ونواتج الأيض ، من المهم مراقبة الخطوط المبوبة والمكتبات الموسومة بالتناسب لفهم وظيفة وأهمية النشا في البذور بشكل أفضل. بالإضافة إلى ذلك، فإن جينبنك الأرز الدولي يحمل أكثر من 130 000 انضمام الأرز27. تقنية الفينوتيبينج البذور السريعة مثل تلك المعروضة هنا من شأنه أن يعجل التصنيف وأخذ العينات للجودة الغذائية28. وأخيرا، قد تكون هذه التقنية مفيدة في ضوء التعدي على آثار تغير المناخ. وقد تم بالفعل تحديد الإجهاد الموسمي في درجة الحرارة العالية أثناء ملء الحبوب كسبب رئيسي للطباشير6، ولكن الدراسات الحديثة تورطت في ارتفاع درجات الحرارة العالمية في زيادة الطباشير من غلة الأرز7،29. وقد تساعد هذه الفينوتيبينج المعجلة للاندوسبيرم في توفير صورة زراعية واسعة النطاق لتأثير زيادة درجات الحرارة العالمية.

حبيبات النشا (SGs) معرض مورفولوجيا مختلفة اعتمادا على الأنواع النباتية، وخاصة في endosperm من عائلة Poaceae 1،2. يمكن استخدام الفينوتينينج الإندوسبيرم لتصنيف الأنماط الجينية على أساس النمط الظاهري SG باستخدام التحليل المجهري الإلكتروني المسح الضوئي. يمكن تصور SGs باستخدام المسح المجهري الإلكتروني (SEM) عن طريق تقطيع النواة والتطفل بعيدا جدران الخلايا endosperm2.
الغرض من هذه التقنية هو إعداد أقسام نواة الأرز العرضية بسهولة فقط لتحليل SEM السريع. وكان الدافع وراء تطوير هذه التقنية هو ضرورة اتباع نهج سريع للتجزأ العرضي يتم بموجبه إعداد العينات للفحص المجهري ل SEM مباشرة قبل التصور باستخدام الحد الأدنى من المعدات.
تتضمن هذه التقنية إدخال نواة الأرز المقشورة في طرف المصصة للشلل التام. وهذا مهم بشكل خاص عند المقاطع العرضية الأنماط الظاهرية نواة الأرز طباشيري، والتي هي قابلة للتفتيت وتنهار بسهولة تحت الضغط3. الطباشيرية هي نوعية غير مرغوب فيها في الأرز لأنها تؤثر على مظهر النواة وتسبب النواة لكسر بسهولة أثناء تلميع وطحن3. Chalkiness يقدم كمنطقة مبهمة في مقطع عرضي من النواة التي يمكن ملاحظتها بالعين المجردة. على المستوى المجهري ، يتميز الطباشير حبيبات النشا الصغيرة المعبأة بشكل فضفاض. أسباب الطباشير يمكن أن تكون وراثية4،5 أوالبيئية 6،7.
وقد تم تقليديا إعداد المقاطع العرضية بذور الحبوب باستخدام أساليب تحديد المواد الكيميائية والتقطيع بعد تضمين عينة في شمع البارافين أو مصفوفة صلبة أخرى4،8،9،10. في عام 2010، تم إدخال طريقة ماتسوشيما كوسيلة لتجنب معقدة وتستغرق وقتا طويلا إعداد عينة نواة الأرز4. تضمن هذا الأسلوب إدراج نواة الأرز المقشورة في طرف ماصة مبتور. يتم الاحتفاظ بالطرف ثابتا بواسطة أداة تشذيب الكتلة ، ويتم حصاد أقسام الإندوسبيرم الجزئية الرقيقة باستخدام شفرة حلاقة يدوية. تقنية سريعة أخرى تم تطويرها في عام 2016 سمحت بقسمة كاملة رقيقة من مجموعة واسعة من البذور الجافة ، بما في ذلك الأصناف الطباشيرية10. هذه الأساليب حفزت على تطوير تقنية سريعة المعروضة هنا.
هذه التقنية الجديدة مناسبة للباحثين الذين يرغبون في الحصول على مقاطع عرضية سليمة من حبات الأرز لenotyping endosperm وتحليل مورفولوجيا النشا باستخدام SEM.
يمثل هذا البروتوكول تكييفا لطريقة تلميح ماصة ماصة Matsushima المبتورة4، مع العديد من التعديلات الملحوظة: (1) لا يتم إدخال حبات في أي نقطة من هذه التقنية ؛ (1) لا يتم إدخالها في أي نقطة من هذه التقنية؛ (1) يتم إدخال تعديلات على 1. (2) لا يطلب من أداة تشذيب الكتلة أو البروتينات الفائقة إعداد المقاطع. نوع البرية 'شفافة' أصناف (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) وخط "طباشيري" محمود من نيبونباري (ssg1, دون المستوى النشا grain1)4 تم فحصها في هذه الدراسة. وقد تم اختيار هذين الصنفين للتحليل هنا لإظهار الاختلافات التقنية والبصرية في معالجة أقسام الأرز الشفافة والطباشيرية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>JMP 15</td>
			<td>SAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3347N</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenom Pro Desktop SEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PHENOM-PRO</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips RC UNV 250 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17001116</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Pin Stub &#216;12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium</td>
			<td>Micro to Nano</td>
			<td>10-002012-50</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120019</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28618256</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5334</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transverse sectioning of mature rice (oryza sativa l.) kernels for scanning electron microscopy imaging using pipette tips as immobilization support

تظهر حبيبات النشا (SGs) مورفولوجيا مختلفة اعتمادا على أنواع النباتات ، خاصة في بطانة عائلة Poaceae. يمكن استخدام الفينوتينينج الإندوسبيرم لتصنيف الأنماط الجينية على أساس النمط المورفوبي SG باستخدام تحليل المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM). يمكن تصور SGs باستخدام SEM عن طريق تشريح من خلال النواة (pericarp، طبقات aleurone، و endosperm) وفضح محتويات organellar. تتطلب الطرق الحالية أن تكون نواة الأرز جزءا لا يتجزأ من الراتنج البلاستيكي وتقسم باستخدام ميكروتوم أو جزءا لا يتجزأ من طرف ماصة مبتورة ومقسمة باليد باستخدام شفرة حلاقة. وتتطلب الطريقة الأولى معدات متخصصة وتستغرق وقتا طويلا، في حين أن الطريقة الثانية تطرح مجموعة جديدة من المشاكل تبعا للنمط الجيني للأرز. أصناف الأرز الطباشيري، على وجه الخصوص، تشكل مشكلة لهذا النوع من الأقسام بسبب الطبيعة القابلة للتفتيت من أنسجة الاندوسبيرم الخاصة بهم. هنا هو تقنية لإعداد شفافة والطباشيري أقسام نواة الأرز للفحص المجهري، تتطلب نصائح ماصة فقط وشفرة مشرط. إعداد المقاطع داخل حدود طرف ماصة يمنع نواة الأرز الاندوسبيرم من التحطم (للأنماط الظاهرية شفافة أو "الزجاجية") وتنهار (للأنماط الظاهرية الطباشيرية). باستخدام هذه التقنية، يمكن ملاحظة نقوش الخلايا الداخلية وبنية SGs سليمة.

نوع البرية Nipponbare (الشكل 2A) وأقسام ssg1 (الشكل 2B) تم فحصها تحت ثلاثة تكبيرات: 260x، 920x، و 4200x. هذه التقنية تسمح لإعداد أقسام ذات جودة كافية لمراقبة الخلية endosperm كامل (الشكل 3A)، حبيبات النشا المركب (الشكل 3B)، والغرانول الفردية (الشكل 3C). حبات قشر يستغرق وقتا أطول لمعالجة من حبات مصقول كما هياكل الجافة تحتاج إلى إزالتها عن طريق الكشط قبل تقسيم. حبات طباشيري أيضا يستغرق وقتا أطول لمعالجة من حبات شفافة مصقول، كما يجب توخي الحذر لعدم تحطيم النواة أثناء المقطع. يجب أن يكون قسم الأرز المعد بشكل صحيح سمكه حوالي 0.9 مم (الجدول 1) مع الحد الأدنى من تحطيم الإندوسبيرم(الشكل 1N)وطبقات بيريكارب وألوروني سليمة (الشكل 1O). وضع غير لائق للمشرط على طرف ماصة عند تقسيم يمكن أن يؤدي إلى أقسام "متكسرة"(الشكل 1P). وبالمثل، أظهرت الصور الميدانية الساطعة للأقسام العرضية المثلى من ssg1 (الشكل 1Q) endosperm سليمة، pericarp، وطبقات aleurone سليمة ومتاحة للتصور (الشكل 1R). قد يكون مقطع النواة الطباشيري المكسور(الشكل 1S)لا يزال قابلا للاستخدام للتصور إذا كان الغرض الوحيد هو مراقبة SGs ، ولكن لن يكون نمط الخلية endosperm مرئيا. قد يكون من الصعب التعامل مع مقطع مكسور للتحليل. ولوحظ المزيد من القص من جدران الخلايا endosperm في نوع البرية Nipponbare، كما هي معبأة أكثر إحكاما الخلايا وأقل قابلية للتفتيت من حبات ssg1. لم يلاحظ أي قص لخلايا الإندوسبيرم في أقسام ssg1 وحبيبات النشا المركبة سليمة.
يوضح الشكل S1 موثوقية النتائج باستخدام تقنية "التلسكوب" لقسم حبات الأرز. خطوط الأرز التي تم تحديدها كمنتجين نواة شفافة – البرية نوع مقاومة النشا (RS) خط هجين Xieyou 7954 (Oryza sativa L. ssp. indica)12,13,14 ( الشكلS1A) والكوبالت المولدة متحولة RS11113,15 ( الشكلS1B) أنتجت الأقسام التي من خلالها كان الضوء مرئيا باستخدام منظار ستيريوميكيروسكوب. وكشفت الصور المقابلة SEM أن هذه الخطوط تنتج النمط الظاهري 'العادي' الاندوسبيرم الأرز: معبأة بإحكام، حبيبات النشا متعددة الهدرالية. Chalky نواة المنتجين ، والتجارية متنوعة يي تانغ16 (الشكل S1C)و RS413، متحولة من RS11115 (الشكل S1D) ، وعرض الأبيض ، أقسام نواة مبهمة. صور SEM المقابلة المعروضة مورفولوجيا مختلفة بشكل ملحوظ بالمقارنة مع نوع البرية شفافة RS خط الخلفية: كانت حبيبات النشا جولة ومعبأة فضفاضة. البرية نوع Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (الشكل S1E) ومتحولة لها ، KMD1 (Kemingdao1) ، والتي تعبر عن الجين Cry1Ab لمنع افتراس الحشرات17،18،19 ( الشكلS1F) عرضت أقسام و endosperm morphotypes مماثلة لخطوط RS شفافة.
التقنية المعروضة هنا هي الأمثل لإعداد عينات من حبات الأرز من نوع طباشيري للتحليل الظاهري، ولكن يوفر أيضا مزايا لقسم الأنماط الظاهرية نواة الأرز شفافة20:تشريح العينات باستخدام الضغط من فوق يقلل من خطر تحطيم الاندوسبيرم والخلع. ويمكن بسهولة إعداد العينات في غضون ثوان(الجدول 2). تم تحليل أنماط جينية متعددة باستخدام هذه التقنية لاختبار فعاليتها (الجدول 3). كما هو مبين في الشكل S2، يمكن تطبيق هذه التقنية على بذور الأنواع الأخرى. نموذج مونوكوت براتاثيون Brachypodium تنتج بذور صلبة جدا تحتوي فقط على بي حبيبات النشا21، والتي تفتقر إلى puroindoline A ، وهو البروتين الذي يمنح ليونة ل حبيبات النشا22. كان لا يزال من الممكن الحصول على مقطع عرضي سليم(الشكل S2A). كان الحصول على مقطع عرضي سليم من القمح الشتوي الأبيض الناعم (SWWW) صعبا ولكن يمكن تنفيذه(الشكل S2B). بذور SWWW عالية في puroindoline A وكبيرة بالمقارنة مع بذور B. distachyon وحبات الأرز. هذه البذور تنهار في كثير من الأحيان عند تقسيم باستخدام تجميع التلسكوب.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الجيني</td>
			<td>متوسط عرض المقطع (ميكرومتر) باستخدام تجميع التلسكوب</td>
			<td>متوسط عرض المقطع (μm) المقطع اليدوي</td>
		</tr>
<tr>
<td>نيبونباري (أجش)</td>
			<td>971.7 ± 152.4ab
</td>
			<td>1059.571 ± 394.2ab
</td>
		</tr>
<tr>
<td>شييو 7954</td>
			<td>825.1 ± 128.3ب
</td>
			<td>1306.187 ± 179.1أ
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>910.6 ± 165.0ab
</td>
			<td>1126.694 ± 395.3ab
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">لا تختلف الوسائل متبوعة بنفس الحروف اختلافا كبيرا في P < 0.01 باستخدام تحليل أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA) واختبار Tukey (n = 10). وأجريت تحليلات إحصائية باستخدام برنامج JMP 15.</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: متوسط سمك قسم النواة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الجيني</td>
			<td>متوسط الوقت (ق)*</td>
		</tr>
<tr>
<td>نيبونباري (أجش)</td>
			<td>14.7 ± 1.36أ
</td>
		</tr>
<tr>
<td>شييو 7954</td>
			<td>9.81 ± 0.98ب
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>11.9 ± 1.28ج
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">* باستخدام تجميع التلسكوب.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">لا تختلف الوسائل متبوعة بنفس الحروف اختلافا كبيرا في P < 0.01 باستخدام تحليل أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA) واختبار Tukey (n = 10). وأجريت تحليلات إحصائية باستخدام برنامج JMP 15.</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: متوسط وقت إعداد العينة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الجيني</td>
			<td>خلفية</td>
			<td>جودة</td>
		</tr>
<tr>
<td>نيبونباري</td>
			<td>نوع البرية</td>
			<td>شفافه</td>
		</tr>
<tr>
<td>
دون المستوى النشا الحبوب1 (ssg1)</td>
			<td>نيبونباري</td>
			<td>طباشيري</td>
		</tr>
<tr>
<td>النشا المقاوم (RS) شييو 7954</td>
			<td>نوع البرية</td>
			<td>شفافه</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS111</td>
			<td>شييو 7954</td>
			<td>شفافه</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>RS111</td>
			<td>طباشيري</td>
		</tr>
<tr>
<td>يي تانغ، "حياة جديدة"، العلامة التجارية لوجورين</td>
			<td>شييو 7954</td>
			<td>طباشيري</td>
		</tr>
<tr>
<td>شيوشوي 11</td>
			<td>نوع البرية</td>
			<td>شفافه</td>
		</tr>
<tr>
<td>كيمينغداو1 (KMD1)</td>
			<td>شيوشوي 11</td>
			<td>شفافه</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 3: الأنماط الجينية للأرز التي تم فحصها في هذه الدراسة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig01.jpg"> الشكل 1: إعداد أقسام الأرز المستعرض. (أ) البرية نوع نيبونباري النواة مع قشر سليمة. (ب).وضعت نواة على سدادة مطاطية مسطحة قطرها أربعة بوصة. (ج)تمت إزالة قشور عن طريق طحن النواة بين اثنين من سدادات المطاط apposing. (د)تم فصل قشر من نواة الأرز. (ه) عن قرب من نواة الأرز قشور. يشار إلى نهاية الجنين. (F) إدراج النواة في تلميح ماصة باستخدام ملقط ناعم. (G)تم تقديم النواة في نهاية بعيدة من طرف ماصة. (H) إدراج طرف ماصة الثاني لشل النواة للتقسم (تجميع 'التلسكوب'). (I)تم تركيب نواة الأرز بشكل مريح في نهاية بعيدة من طرف ماصة. (J) تقسيم نواة الأرز داخل التجميع. (ك) عن قرب من قطع المقطع. (L) قسم من النواة محاطة أنولوس البلاستيك. (M) عن قرب من المقطع العرضي. (N) المقطع المستعرض من نوع البرية نيبونباري. (O) عن قرب من endosperm داخل نوع البرية Nipponbare القسم. (P) الفقراء، دون المستوى الأمثل قسم من نوع البرية نواة نيبونباري. (س) المقطع المستعرض من نيبونباري متحولة ssg14. (R) عن قرب من الاندوسبيرم داخل القسم ssg1. (S) الفقر، دون المستوى الأمثل قسم من ssg1. شريط (لوحات A، N-S)= 1 مم. تم تصوير نواة الأرز الكاملة والأقسام باستخدام مجسم مع كاميرا التكبير الرقمية وأضواء gooseneck. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig02.jpg"> الشكل 2: صور SEM لأقسام النواة العرضية. (أ) نوع البرية نيبونباري، وهو أصناف شفافة. تم تدعيم حبيبات النشا المركبة بإحكام إلى بعضها البعض. (ب) نيبونباري متحولة ssg14, النمط الظاهري طباشيري. كانت حبيبات النشا المركبة معبأة بشكل فضفاض وتفتقر إلى الطبيعة الإسمنتية للنوع البري نيبونباري نشا مورفوتيبي. التكبير من اليسار إلى اليمين: 260x، 920x، و 4200x. يشار إلى طول الشريط في لوحات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig03.jpg"> الشكل 3: علم التشريح المجهري SEM لقسم النواة المستعرضة من Xiushui 11. (أ)يتم تحديد خلية واحدة endosperm باللون الأحمر. 260x التكبير. (ب)ويرد في حبيبات النشا المركب باللون الأحمر. 920x التكبير. (ج)ويرد وصف subgranules النشا متعددة باللون الأحمر. 2250x التكبير. يشار إلى أطوال الشريط في اللوحات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل S1: أقسام عرضية من الأنماط الجينية للأرز الأخرى المعدة ل SEM باستخدام هذه التقنية. (أ) النشا المقاوم (RS) شييو 795412. (ب) RS111، متحولة شفافة عالية RS من 795413. (C) RS4، متحول طباشيري من RS11115. (د) يي تانغ، مجموعة متنوعة تجارية من الأرز اميلوز عالية16. (ه) شيوشوى 11. (واو) KMD1 (Kemingdao1)17،18،19. تكبير 10x لصور المجال الساطع. شريط أبيض = 1 مم 2250x تكبير لصور SEM. يشار إلى أطوال الشريط في اللوحات. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407supfig01.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.</a>
الشكل S2: تقنية مفيدة للبذور الأخرى. (أ) المقطع المستعرض من بروم الأرجواني كاذبة (Brachypodium distachyon L. الانضمام Bd21) البذور. (ب) المقطع المستعرض من القمح الشتوي الأبيض الناعم(تريتيكوم aestivum L. cv. Augusta) البذور. حقل مشرق، تكبير 20x. شريط = 1 مم. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407supfig02.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support at JoVE.com

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

يسمح هذا البروتوكول بإعداد أقسام عرضية من بذور الحبوب (مثل الأرز) لتحليل مورفولوجيا حبيبات الإندوسبيرم والنشا باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي.

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

يسمح هذا البروتوكول بتقطيع البذور إلى شرائح سليمة حتى لا تنهار ، مما يسمح بتصور حبيبات النشا في أي بذور يمكن أن تندرج في طرف ماصة. يدعم المخروط البلاستيكي القابل للمرونة الهيكل الأصلي للأنسجة الجافة والأعضاء ، لذلك يسمح هذا متعدد العينات الرخيص والسهل بمعالجة العديد من العينات في وقت قصير. للذهاب من ميزة المجهر الطب الشرعي هنا، النشا المقاوم، وهو ما نبحث عنه جميعا، وسهولة الوصول إلى الإنزيمات إلى أن النشا الخام، انحلال الأميلوليسيس، مؤشر نسبة السكر في الدم، وارتفاع الجلوكوز، وهذه هي المعلمات الأساسية لتربية أصناف الأرز أفضل لمكافحة مرض السكري من النوع 2 في جميع أنحاء العالم اليوم.والآن من دواعي سروري أن أقدم لك الدكتورة كيا بارتون الدكتورة بارتون من مختبرنا وسوف تستخدم مرفق التصوير الأساسي لأعضاء هيئة التدريس لتظهر لك كيف يتم نشر هذه التقنية. تبدأ بإزالة قشر حبات الجافة.ضع نواة واحدة على سدادة مطاطية مسطحة على مقعد العمل ، وتأكد من أن هذه السدادة لا تزال ثابتة. استخدام سدادة المطاط المسطح الثاني لتآكل النواة عن طريق التواء ضد سدادة المطاط الأول، ثم إزالة قشور من النواة، مع الحرص على عدم تحطيم الاندوسبيرم ولا طحن البذور بقوة جدا بين اثنين من الأرانب المطاطية. إزالة أي قشور المتبقية باستخدام ملقط غرامة وإدراج نواة قشر الفردية في البلاستيك 250 ميكرولتر ماصة تلميح.تأكد من أن نهاية الجنين من النواة تواجه نحو نهاية مخروطية من طرف ماصة. إدراج الثانية 250 ميكرولتر ماصة تلميح لإجبار النواة في تلميح ماصة الأولى والحفاظ على نواة غير متحركة أثناء المقطع، مع الحرص على عدم تلف النواة أو ثني طرف ماصة الثانية. وضع ماصة طرف تجميع شقة على منضدة العمل والاحتفاظ بها في مكان باليد.من ناحية أخرى، استخدم شفرة مشرط حادة لشريحة من خلال وسط النواة، وقطع نهاية طرف ماصة. شريحة إلى أسفل من خلال التجميع ومن ثم توجيه شفرة مشرط عموديا حتى اثنين من وجوه قسم اليد الجديدة المكشوفة موازية. ثم استخدم المشرط لقطع أجزاء سميكة ملليمتر واحد من نواة الأرز.لإجراء المجهر الضوء المنعكس، ضع أقسام الأرز العرضي على قطعة من الورق الأسود قياس الثقيلة. الحصول على صور ضوئية للأقسام العرضية باستخدام مجهر ستيريو مع goosenecks محمولة للإضاءة المائلة، وذلك باستخدام ما لا يقل عن 10 مرات التكبير. تم فحص أقسام نيبونباري وssg1 البرية تحت 260 مرة، 920 مرة، و 4200 مرة التكبير.عندما أعدت بشكل صحيح، كانت أقسام الأرز ما يقرب من 0.9 ملليمتر سميكة مع الحد الأدنى من تحطيم الاندوسبيرم وطبقات بيريكارب سليمة والسورون. تسمح هذه التقنية بإعداد أقسام ذات جودة كافية لمراقبة الخلية الاندوسبيرم بأكملها وحبيبات النشا المركبة والحبيبات الفرعية الفردية. منتجي النواة شفافة، مثل الخط الهجين النشا مقاومة من النوع البري، Zhehui 7954 والكوبالت ولدت RS111 متحولة، أنتجت حبيبات النشا متعددة الهدرات معبأة بإحكام، وهو النمط الظاهري الاندوسبيرم الأرز العادي.صور SEM من منتجي النواة الطباشيرية، متنوعة التجارية يي تانغ و RS4، وعرض حبيبات النشا التي كانت مستديرة ومعبأة فضفاضة. كان لدى Xiushiu 11 البرية وKMD1 المتحولة ، والتي عبرت عن جين Cry1Ab لمنع افتراس الحشرات أقسام وأنماط مورفوتية endosperm مشابهة لخطوط النشا المقاومة الشفافة. ويمكن تطبيق هذه التقنية على بذور الأنواع الأخرى.نموذج monocot، براتاشيون براتاثيون براتشيبوديوم، وتنتج بذور صلبة جدا، ولكن كان لا يزال من الممكن الحصول على قسم عرضي سليمة. كما تم إنتاج أقسام عرضية سليمة من القمح الشتوي الأبيض الناعم. يمكن تطبيق طريقة الفحص السريعة ورخيصة للنظر داخل الهياكل البيولوجية على أرجل الحشرات ، أو مسامير شجرة الفول ، أو الزعرور ، أو العمود الفقري للأسماك ، أو أي مجال من المجهر الشرعي الذي يمكن أن يستفيد من إعداد دعم العينة هذا.بعد تنفيذ هذا البروتوكول، طلاء البلوتر للفحص الكهربائي، تلطيخ مع الأصباغ الفلورية محددة، وتطبيق calcafluor لوصمة عار لسمك جدار الخلية جلوكان بيتا في خطوط الشوفان والشعير متحولة هي بعض الطرق السريعة للاقتراب من تربية النبات مع فحص النمط الظاهري السريع.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

تحليل البروتين الحيوي المجمعات تجميعها على والإفراج عن بيوسينسور بيولايير قياس التداخل باستخدام الطيف الكتلي والمجهر الإلكتروني

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp.

تحسين UPLC-UV طريقة ل الكم من فيتامين (ج) في أصناف الخس(Lactuca sativa L.) والمحاصيل البرية الأقارب(Lactuca spp.)

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

إعداد عينات من أفلام الدعم في المجهر الإلكترون الإرسال باستخدام كتلة دعم التعويم

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

شبكات المجهر الإلكتروني للإرسال بالنمط المجهري لتحديد مواقع الخلايا مباشرة ضمن سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون للخلية الكاملة

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...