Name: transverse sectioning of mature rice (oryza sativa l.) kernels for scanning electron microscopy imaging using pipette tips as immobilization support
Uploaded: 2022-01-25T13:00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support at JoVE.com

Yazarlar, Phenom ProX Desktop SEM enstrümanlarının yanı sıra Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) ve Chloë van Oostende-Triplet (Hücre Biyolojisi ve Görüntü Alma Çekirdek Tesisi, Ottawa Üniversitesi Tıp Fakültesi) tarafından sağlanan teknik yardım için Systems for Research'e (SFR Corp.) minnettardır. Ontario Ekonomik Kalkınma, İş Yaratma ve Ticaret Bakanlığı ve Proteinler Easy Corp. Hükümeti'nden Düşük Karbon İnovasyon Fonu (LCIF) tarafından finansman sağlandı.

1. Enine pirinç bölümünün hazırlanması
<ol><li>Şekil 1A'dagösterildiği gibi kabuksuz kuru, bozulmamış çekirdekler.<ol>
<li>Çekirdekleri iki düz kauçuk durdurucu arasında öğüterek kabukları ve dehull pirinç çekirdeklerini gevşetin. Gerekirse kabuklu pirinç çekirdeklerini panikleden çıkarın.</li>
		<li>Bir çalışma tezgahındaki düz kauçuk stoperin üzerine tek bir çekirdek yerleştirin(Şekil 1B). Bu durdurucu sabit kaldığından emin olun.</li>
		<li>Çekirdeği ilk lastik durdurucuya doğru bükerek aşındırmak için yeterli basınç kullanarak ikinci bir düz kauçuk durdurucu ( Şekil1C) kullanın (Şekil 1D). Endosperm'i parçalamamaya dikkat ederek çekirdekteki kabukları çıkarın. İnce tokmaklar kullanarak kalan kabukları çıkarın. Kabuksuz bir çekirdek Şekil 1E'de gösterilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İnce tokalar kullanarak, plastik bir pipet ucuna (250 μL boyut, bir tohum / uç) tek bir kabuklu çekirdek yerleştirin (Şekil 1F). Çekirdeğin embriyo ucunun pipet ucunun (Konik) ucuna doğru dönük olduğundan emin olun (Şekil 1G). NOT: Çekirdeğin bu şekilde takılması, çekirdek proksimal ucuna doğru daha dar olduğu için çekirdeğin pipet ucuna mümkün olduğunca sıkı oturmasını sağlar.</li>
	<li>Çekirdeği pipet ucuna zorlamak ve bölümleme sırasında çekirdeği hareketsiz tutmak için ikinci bir 250 μL pipet ucu yerleştirin, çekirdeğe zarar vermemeye veya ikinci pipet ucunu bükmemeye dikkat edin (Şekil 1H). Uygun 'teleskop' montajı Şekil 1I'debelirtilmiştir.</li>
	<li>Pipet ucu montajını bir çalışma tezgahına düz bir şekilde yerleştirin ve elle yerinde tutun (Şekil 1J). Öte yandan, çekirdeğin merkezini dilimlemek ve pipet ucunun ucunu kesmek için keskin bir neşter bıçağı (No. 20) kullanın (Şekil 1K). Neşteri kullanarak pirinç çekirdeğinin 1 mm kalınlığında bölümlerini kesin (Şekil 1L). NOT: Çekirdek bölümü bir plastik annulus içinde sıkıca kapatılmış (Şekil 1M). Üç örnek genotip için ortalama kesit kalınlığı Tablo 1'debulunur. 1 mm'den önemli ölçüde daha ince bölümler parçalanır veya parçalanır. Nişasta morfolojisi endosperm boyunca değiştiğinden, bu deney karşılaştırma için çeşitli pirinç çeşitleri üzerinde yapılıyorsa, her bölümün çekirdeğin hangi bölümünden kaynaklandığını not etmekönemlidir.</li>
</ol>2. Enine pirinç bölümlerinin yansıyan ışık mikroskopisi
<ol><li>Enine pirinç bölümlerini (bölüm 1'de hazırlanmış) siyah bir ağır gösterge siyah kağıda yerleştirmek için ince tokmaklar kullanın.</li>
	<li>Şekil 1N-S'degösterildiği gibi, eğik aydınlatma için monte kaz tüyü ile bir stereomikroskop kullanarak Nipponbare'nin enine bölümlerinin ışık görüntülerini elde edin.</li>
	<li>En az 10 kat büyütme altında endosperm morfolojisi gözlemleyin. NOT: Bu teknik kullanılarak elde edilen bölümler ışığın geçeceği kadar ince olmadığı için parlak alan mikroskopisine herhangi bir epilight kaynağı tercih edilir.</li>
</ol>3. Enine pirinç bölümlerinin elektron mikroskopisinin taranır
<ol><li>Numuneleri alüminyum saplama yapışmış bir karbon diske yerleştirin ve şarj azaltma numune tutucusuna yerleştirin. Plastiğin SEM'in vakum aparatına girmesini önlemek için ince önklekler kullanarak plastik halkayı pipet ucu montajından çıkarın. NOT: Endosperm hücrelerinin, SG'lerin ve altgranules'in görüntüleri, numunelerin sputter kaplamalı olmasını gerektirmeyen bir masaüstü SEM makinesi kullanılarak elde edilir.</li>
	<li>Görüntüleri 10 kV'da yüksek hassasiyetli çok modlu arka katman elektron (BSE) dedektörü kullanarak elde edin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>James, M. G., Denyer, K., Myers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch+synthesis+in+the+cereal+endosperm.">Starch synthesis in the cereal endosperm.</a> Current Opinion in Plant Biology. 6 (3), 215-222 (2003).</li><li>Shapter, F. M., Henry, R. J., Lee, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosperm+and+starch+granule+morphology+in+wild+cereal+relatives.">Endosperm and starch granule morphology in wild cereal relatives.</a> Plant Genetic Resources. 6 (2), 85-97 (2008).</li><li>Ashida, K., Iida, S., Yasui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological,+physical,+and+chemical+properties+of+grain+and+flour+from+chalky+rice+mutants.">Morphological, physical, and chemical properties of grain and flour from chalky rice mutants.</a> Cereal Chemistry. 86 (2), 225-231 (2009).</li><li>Matsushima, R., Maekawa, M., Fujita, N., Sakamoto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+direct+observation+method+to+isolate+mutants+with+defects+in+starch+grain+morphology+in+rice.">A rapid, direct observation method to isolate mutants with defects in starch grain morphology in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 728-741 (2010).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stable+QTLs+causing+chalk+in+rice+grains+in+nine+environments.">Identification of stable QTLs causing chalk in rice grains in nine environments.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (1), 141-153 (2016).</li><li>Nagato, K., Ebata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high+temperature+during+ripening+period+on+the+development+and+the+quality+of+rice+kernels.">Effects of high temperature during ripening period on the development and the quality of rice kernels.</a> Japanese Journal of Crop Science. 34 (1), 59-66 (1965).</li><li>Zhao, X., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+change:+implications+for+the+yield+of+edible+rice.">Climate change: implications for the yield of edible rice.</a> PLoS One. 8 (6), 66218 (2013).</li><li>Zhao, Z. K., Mu, T. H., Zhang, M., Richel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high+hydrostatic+pressure+and+microbial+transglutaminase+treatment+on+structure+and+gelation+properties+of+sweet+potato+protein.">Effects of high hydrostatic pressure and microbial transglutaminase treatment on structure and gelation properties of sweet potato protein.</a> LWT - Food Science and Technology. 115, 108436 (2019).</li><li>Feiz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puroindolines+co-localize+to+the+starch+granule+surface+and+increase+seed+bound+polar+lipid+content.">Puroindolines co-localize to the starch granule surface and increase seed bound polar lipid content.</a> Journal of Cereal Science. 50 (1), 91-98 (2009).</li><li>Zhao, L., Pan, T., Guo, D., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+preparing+the+whole+section+of+starchy+seed+to+investigate+the+morphology+and+distribution+of+starch+in+different+regions+of+seed.">A simple and rapid method for preparing the whole section of starchy seed to investigate the morphology and distribution of starch in different regions of seed.</a> Plant Methods. 14 (1), 16 (2018).</li><li>Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+whole+sections+of+mature+cereal+seeds+to+visualize+the+morphology+of+endosperm+cell+and+starch+and+the+distribution+of+storage+protein.">Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein.</a> Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).</li><li>Li, C., Dong, S., Li, G., Yuan, G., Dong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+and+application+of+the+new+combination+of+hybrid+rice+"Xieyou+7954".">Breeding and application of the new combination of hybrid rice "Xieyou 7954".</a> Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences). 19 (3), 179-181 (2002).</li><li>Shu, X., Jia, L., Ye, H., Li, C., Wu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+digestion+properties+of+rice+different+in+resistant+starch.">Slow digestion properties of rice different in resistant starch.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (16), 7552-7559 (2009).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+soluble+starch+synthase+SSIIIa+and+granule-bound+starch+synthase+Waxy+in+synthesizing+resistant+starch+in+rice.">Critical roles of soluble starch synthase SSIIIa and granule-bound starch synthase Waxy in synthesizing resistant starch in rice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (45), 12844-12849 (2016).</li><li>Yang, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starch+properties+of+mutant+rice+high+in+resistant+starch.">Starch properties of mutant rice high in resistant starch.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, 523-528 (2006).</li><li>Zhou, Y., Zou, Y., Jiang, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+methods+for+resistance+starch+content+of+Yi-Tang+rice+and+optimization+of+pretreatment.">Detection methods for resistance starch content of Yi-Tang rice and optimization of pretreatment.</a> Food Science and Biotechnology. 36, 416-419 (2017).</li><li>Cheng, X., Sardana, R., Kaplan, H., Altosaar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-transformed+rice+plants+expressing+synthetic+cryIA(b)+and+cryIA(c)+genes+are+highly+toxic+to+striped+stem+borer+and+yellow+stem+borer.">Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2767-2772 (1998).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+P-35S+and+T-nos+in+genetically+modified+organisms+by+recombinase+polymerase+amplification+combined+with+a+lateral+flow+strip.">Rapid detection of P-35S and T-nos in genetically modified organisms by recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow strip.</a> Food Control. 107, 106775 (2020).</li><li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rice+plants+with+a+synthetic+cry1Ab+gene+from+Bacillus+thuringiensis+were+highly+resistant+to+eight+lepidopteran+rice+pest+species.">Transgenic rice plants with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis were highly resistant to eight lepidopteran rice pest species.</a> Molecular Breeding. 6 (4), 433-439 (2000).</li><li>Lisle, A. J., Martin, M., Fitzgerald, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chalky+and+translucent+rice+grains+differ+in+starch+composition+and+structure+and+cooking+properties.">Chalky and translucent rice grains differ in starch composition and structure and cooking properties.</a> Cereal Chemistry. 77 (5), 627-632 (2000).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+starch+granules+and+the+regulation+of+starch+biosynthesis+in+Brachypodium+distachyon:+comparison+with+common+wheat+and+Aegilops+peregrina.">Dynamic development of starch granules and the regulation of starch biosynthesis in Brachypodium distachyon: comparison with common wheat and Aegilops peregrina.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 198 (2014).</li><li>Giroux, M. J., Morris, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+grain+hardness+results+from+highly+conserved+mutations+in+the+friabilin+components+puroindoline+a+and+b.">Wheat grain hardness results from highly conserved mutations in the friabilin components puroindoline a and b.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6262-6266 (1998).</li><li>Matsushima, R., Hisano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+amyloplasts+in+the+developing+endosperm+of+barley+and+rice.">Imaging amyloplasts in the developing endosperm of barley and rice.</a> Scientific Reports. 9, 3745 (2019).</li><li>Matsushima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloplast-localized+SUBSTANDARD+STARCH+GRAIN4+protein+influences+the+size+of+starch+grains+in+rice+endosperm.">Amyloplast-localized SUBSTANDARD STARCH GRAIN4 protein influences the size of starch grains in rice endosperm.</a> Plant Physiology. 164 (2), 623-636 (2014).</li><li>Monjardino, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+flange+and+reticulate+wall+ingrowths+in+maize+(Zea+mays+L.)+endosperm+transfer+cells.">Development of flange and reticulate wall ingrowths in maize (Zea mays L.) endosperm transfer cells.</a> Protoplasma. 250 (2), 495-503 (2013).</li><li>Tizro, P., Choi, C., Khanlou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+transmission+electron+microscopy.">Sample preparation for transmission electron microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 417-424 (2019).</li><li>Liu, Q. H., Zhou, X. B., Yang, L. Q., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chalkiness+on+cooking,+eating+and+nutritional+qualities+of+rice+in+two+indica+varieties.">Effects of chalkiness on cooking, eating and nutritional qualities of rice in two indica varieties.</a> Rice Science. 16 (2), 161-164 (2009).</li><li>Morita, S., Wada, H., Matsue, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures+for+heat+damage+in+rice+grain+quality+under+climate+change.">Countermeasures for heat damage in rice grain quality under climate change.</a> Plant Production Science. 19 (1), 1-11 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada sunulan teknik, masaüstü SEM görselleştirmesi için enine pirinç kesitleri hazırlamaya yönelik hızlı, basit ve keskin bir yaklaşımı temsil eder. Bu kesit tekniği endosperm yapısının, endosperm hücre şeklinin, boyutunun ve deseninin, bileşik granüllerin ve nişaste morfolojisinin hızlı bir şekilde gözlemlenmesine olanak tanır. Endosperm fenotipleme ve germplasm taraması amacıyla, pirinç çekirdeğinin 4,23,24kesitinin tamamını elde etmek önemlidir. Neşter bıçağının basıncının endosperim'i parçalanmaya veya parçalanmaya zorlamasını önlemek için çekirdeği tamamen pipet ucuna yerleştirmek çok önemlidir. 'Teleskop' montajının düzgün bir şekilde inşa edilmesi koşuluyla, numuneler tipik bir laboratuvar ortamında zaten mevcut malzemelerin kullanılarak 15 saniye içinde(Tablo 2)görselleştirme için hazırlanabilir. Bu teknik, çapı yaklaşık dört milimetre olan herhangi bir elipsoidal tohumun en geniş noktasında kesiti için geçerlidir. Model çim Brachypodium distachyon tohumları (Şekil S2A) benzer şekilde bölümlerek olabilir, ancak annulus içinde kapalı kalmaz. Buğday gibi daha büyük tohumlar kolayca kırılır ve kesitlerken bakım gerektirir (Şekil S2B).
Ancak, burada sunulan tekniğin birkaç sınırlaması vardır. Bu teknik kullanılarak elde edilen bölümler, parlak alan (pirinç çekirdeği bölümleri için 500 μm maksimum numune kalınlığı25)ve iletim elektron mikroskopisi (TEM) (500 nm maksimum numune kalınlığı26) gibi iletilen ışık bazlı mikroskobik yaklaşımlar için bu tekniğin kullanılmasını yasaklayan ışığın geçmesi için yeterince ince değildir. ). Pipet ucunun kesit 'matrisi' olarak kullanılması, bu teknik kullanılarak bölümlendirilebilen tohumun boyutunu da sınırlar. Pirinçten oldukça farklı türler için bu tekniği uyarlamak için daha fazla sorun giderme gerekir ve 'matrisin' boyutu satın alınabilecek pipet uçlarının boyutu ile sınırlıdır.
Bu tekniğin sağladığı bir diğer belirgin avantaj da tebeşirli fenotip pirinç çekirdeklerinden üretilebilen örneklerin kalitesidir. Matsushima çalışmasının bile tebeşirli fenotipler için bu özel yöntemi kullanarak kesit eldeetmeninzor olduğunu kabul ettiğini belirtmek gerekir 4 Bu çalışmada karşılaştırma amacıyla çoğaltıldığı gibi (Şekil 1S). Onların durumunda, tebeşirli pirinç örneklerini kimyasal olarak sabitlemek ve bölümleme için reçineye gömmek gerekli hale geldi. Yeni teknik, masaüstü SEM görüntüleme ile birlikte, araştırmacının pirinç çekirdeklerinin enine bölümlerini mikroskobu için immobilizasyon desteği olmadan daha fazla tutarlılıkla kolayca hazırlamasını sağlar (Tablo 3).
Fenomik ve metabolomik yeni çağda, nişastanın tohumlardaki işlevini ve önemini daha iyi anlamak için mutajen çizgilerini ve transposon etiketli kütüphaneleri izlemek önemlidir. Ayrıca, Uluslararası Pirinç Gen Bankası 130.000'den fazla pirinç katılımını elinde bulundursa27. Burada sunulan gibi hızlı bir tohum fenotipleme tekniği, beslenme kalitesi için sınıflandırma ve örneklemesi hızlandırır28. Son olarak, bu teknik iklim değişikliği etkilerinin aşınması ışığında yararlı olabilir. Tahıl doldurma sırasında mevsimsel yüksek sıcaklık stresi zaten tebeşirlemenin önemli bir nedeni olarak tanımlanmıştı6, ancak son çalışmalar pirinç veriminin artan tebeşirliliğine artan küresel sıcaklıkları7,29'abulaştırdı. Bu tür hızlandırılmış endosperm fenotipleme, artan küresel sıcaklıkların etkisinin geniş bir tarımsal görüntüsünü sağlamaya yardımcı olabilir.

Nişasta granülleri (SG'ler), özellikle Poaceae ailesinin endosperminde bitki türlerine bağlı olarak farklı morfolojiler sergiler1,2. Endosperm fenotipleme, taramalı elektron mikroskobik analizi kullanılarak SG fenotipine dayalı genotipleri sınıflandırmak için kullanılabilir. SG'ler, çekirdeği dilimleyerek ve endosperm hücre duvarlarını çıkararak taramalı elektron mikroskopisi (SEM) kullanılarak görselleştirilebilir2.
Bu tekniğin amacı, enine pirinç çekirdeği bölümlerini sadece hızlı SEM analizi için kolayca hazırlamaktır. Bu tekniğin geliştirilmesi, minimal ekipman kullanılarak görselleştirmeden hemen önce SEM mikroskopisi için numunelerin hazırlandığı hızlı bir kesit yaklaşımının gerekliliği ile motive edildi.
Bu teknik, tamamen hareketsiz hale getirilmesi için kabuklu pirinç çekirdeğinin pipet ucuna yerleştirilmesini içerir. Bu, özellikle, kırılgan ve basınç altında kolayca ufalanan tebeşirli pirinç çekirdeği fenotiplerini kesişirken önemlidir3. Tebeşirleme, çekirdeğin görünümünü etkilediği ve parlatma ve frezeleme sırasında çekirdeğin kolayca kırılmasına neden olduğu için pirinçte istenmeyen bir kalitedir3. Tebeşirlik, çekirdeğin çıplak gözle gözlemlenebilen bir kesitinde opak bir alan olarak ortaya çıkan; mikroskobik düzeyde, tebeşirlik küçük, gevşek paketlenmiş nişasta granülleri ile karakterizedir. Tebeşirliliğin nedenleri genetik4,5 veya çevresel6,7olabilir.
Tahıl tohumu kesitleri geleneksel olarak kimyasal sabitleme yöntemleri kullanılarak ve parafin balmumuna veya başka bir katı matris 4 , 8,9,10'akatı gömmeden sonra bölümleme kullanılarak hazırlanmıştır. 2010 yılında, Matsushima yöntemi karmaşık ve zaman alıcı pirinç çekirdeği numunesi hazırlanmasından kaçınmanın bir yolu olarak tanıtıldı4. Bu yöntem, kabuklu pirinç çekirdeğinin kesilmiş bir pipet ucuna yerleştirilmesini içeriyordu. Uç bir blok düzeltici tarafından sabit tutulur ve ince, kısmi endosperm bölümleri elde tutulan bir jilet kullanılarak toplanır. 2016 yılında geliştirilen başka bir hızlı teknik, tebeşirli çeşitler de dahil olmak üzere çok çeşitli kuru tohumların ince bütün kesitine izin verildi10. Bu yöntemler burada sunulan hızlı tekniğin gelişimini motive etti.
Bu yeni teknik, SEM kullanarak endosperm fenotipleme ve nişasta morfoloji analizi için pirinç çekirdeklerinin bozulmamış enine kesitlerini elde etmek isteyen araştırmacılar için uygundur.
Bu protokol, Matsushima kesilmiş pipet ucu yöntemi4'ün birkaç önemli değişiklikle bir uyarlamasını temsil eder: (1) çekirdekler tekniğin herhangi bir noktasında imbibed değildir; (2) bölümleri hazırlamak için ne bir blok düzeltici ne de bir ultramikrotom gereklidir. Bu çalışmada vahşi bir 'yarı saydam' kültivar(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) ve nipponbare mutajize edilmiş 'tebeşirli' bir çizgi (ssg1, standart altı nişasta tanesi1)4 incelenmiştir. Bu iki kültivar, yarı saydam ve tebeşir tipi pirinç bölümlerinin işlenmesindeki teknik ve görsel farklılıkları göstermek için buradaki analiz için seçildi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>JMP 15</td>
			<td>SAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3347N</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenom Pro Desktop SEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PHENOM-PRO</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips RC UNV 250 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17001116</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Pin Stub &#216;12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium</td>
			<td>Micro to Nano</td>
			<td>10-002012-50</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120019</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28618256</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5334</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transverse sectioning of mature rice (oryza sativa l.) kernels for scanning electron microscopy imaging using pipette tips as immobilization support

Nişasta granülleri (SG'ler), özellikle Poaceae ailesinin endosperminde bitki türlerine bağlı olarak farklı morfolojiler sergiler. Endosperm fenotipleme, taramalı elektron mikroskobik (SEM) analizini kullanarak genotipleri SG morfotipine göre sınıflandırmak için kullanılabilir. SG'ler çekirdekten dilimlenerek (perikarp, aleuron katmanları ve endosperm) ve organeller içeriği açığa açığa alarak SEM kullanılarak görselleştirilebilir. Mevcut yöntemler, pirinç çekirdeğinin plastik reçineye gömülmesini ve bir mikrotom kullanılarak bölümlere ayrıştırılmasını veya kesilmiş bir pipet ucuna gömülmesini ve jilet kullanılarak elle bölümlerek kesilmesini gerektirir. Eski yöntem özel ekipman gerektirir ve zaman alıcıdır, ikincisi ise pirinç genotipine bağlı olarak yeni bir dizi sorun ortaya sunar. Tebeşirli pirinç çeşitleri, özellikle, endosperm dokularının kırılgan doğası nedeniyle bu tür kesitler için bir sorun teşkil ediyor. Burada sunulan, sadece pipet uçları ve neşter bıçağı gerektiren mikroskopi için yarı saydam ve tebeşirli pirinç çekirdeği bölümlerini hazırlamak için bir tekniktir. Pipet ucunun sınırları içindeki bölümlerin hazırlanması, pirinç çekirdeği endosperminin parçalanmasını (yarı saydam veya 'vitreus' fenotipler için) ve parçalanmasını (tebeşirli fenotipler için) önler. Bu teknik kullanılarak endosperm hücre deseni ve sağlam SG'lerin yapısı gözlenebilir.

Yabani tip Nipponbare (Şekil 2A) ve ssg1 bölümleri (Şekil 2B) üç büyütme altında incelenmiştir: 260x, 920x ve 4200x. Bu teknik, tüm endosperm hücresini gözlemlemek için yeterli kalitede bölümlerin hazırlanmasını sağlar (Şekil 3A), bileşik nişaste granülleri (Şekil 3B) ve bireysel altgranüller (Şekil 3C). Kabuklu çekirdeklerin işlenmesi cilalı çekirdeklerden daha uzun sürer, çünkü kuru gövdelerin bölümlemeden önce aşınma ile çıkarılması gerekir. Tebeşirli çekirdeklerin işlenmesi de cilalı yarı saydam çekirdeklerden daha uzun sürer, çünkü bölümleme sırasında çekirdeğin parçalanmaması için dikkatli olunmalıdır. Düzgün hazırlanmış bir pirinç bölümü yaklaşık 0,9 mm kalınlığında olmalıdır (Tablo 1) endosperm(Şekil 1N)ve bozulmamış perikarp ve aleuron katmanlarının(Şekil 1O)en az veya hiç parçalanmaması ile. Kesitleme sırasında neşterin pipet ucuna yanlış yerleştirilmesi 'yontulmuş' bölümlere yol açabilir (Şekil 1P). Benzer şekilde, ssg1'in en uygun enine bölümlerinin parlak alan görüntüleri (Şekil 1Q) bozulmamış endosperm, perikarp ve aleuron katmanlarını bozulmamış ve görselleştirme için kullanılabilir göstermiştir (Şekil 1R). Kırık tebeşirli çekirdek bölümü (Şekil 1S) tek amaç SG'leri gözlemlemekse görselleştirme için hala kullanılabilir, ancak endosperm hücre deseni görünmez. Kırık bir bölümü analiz için işlemek zor olabilir. Endosperm hücre duvarlarında daha fazla kesme vahşi tip Nipponbare gözlendi, çünkü hücreler ssg1 çekirdeklerinden daha sıkı paketlenmiş ve daha az kırılgan. Ssg1 bölümlerinde endosperm hücrelerinde yamulma gözlenmedi ve bileşik nişasta granülleri sağlam.
Şekil S1, pirinç çekirdeklerini bölümlerek 'teleskop' tekniğini kullanarak sonuçların güvenilirliğini gösterir. Yarı saydam çekirdek üreticileri olarak tanımlanan pirinç hatları - vahşi tip Dirençli Nişasta (RS) hibrid hattı Xieyou 7954 (Oryza sativa L. ssp. indica)12,13,14 (Şekil S1A) ve kobalt tarafından üretilen mutant RS11113,15 ( ŞekilS1B) stereomikroskop kullanılarak ışığın görülebildiği bölümler üretti. İlgili SEM görüntüleri, bu çizgilerin 'normal' pirinç endosperm fenotipini ürettiğini ortaya koydu: sıkıca paketlenmiş, polihedral nişasta granülleri. Tebeşirli çekirdek üreticileri, ticari çeşitlilik Yi-Tang16 (Şekil S1C) ve RS413, RS11115 'in bir mutantını (Şekil S1D), beyaz, opak çekirdek bölümleri sergilediler. İlgili SEM görüntüleri, vahşi tip yarı saydam RS arka plan çizgisine kıyasla belirgin şekilde farklı morfoloji gösterdi: nişasta granülleri yuvarlak ve gevşek bir şekilde paketlenmişti. Vahşi tip Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (Şekil S1E) ve böcek predasyonunu inhibe etmek için Cry1Ab genini ifadeeden kmd1 (Kemingdao1) yarı saydam RS hatlarına benzer bölümler ve endosperm morfotipleri sergiledi.
Burada sunulan teknik, fenotipik analiz için tebeşir tipi pirinç çekirdeklerinin örneklerini hazırlamak için en uygunudur, ancak yarı saydam pirinç çekirdeği fenotiplerini bölümlere ayırmada da avantajlar sağlar20: örnekleri yukarıdan basınç kullanarak dilimleme, endosperm ve çıkık riskini azaltır. Örnekler saniyeler içinde kolayca hazırlanabilir (Tablo 2). Etkinliğini test etmek için bu teknik kullanılarak birden fazla genotip analiz edilmiştir (Tablo 3). Şekil S2'degösterildiği gibi, bu teknik diğer türlerin tohumlarına uygulanabilir. Model monokot Brachypodium distachyon sadece B granül nişastası içeren çok sert tohumlar üretir21, puroindoline A eksikliği, nişasta granüllerine yumuşaklık sağlayan bir protein22. Sağlam bir enine bölüm elde etmek hala mümkündü (Şekil S2A). Yumuşak beyaz kış buğdayından (SWWW) sağlam bir enine bölüm elde etmek zordu, ancak yapılabilir (Şekil S2B). SWWW tohumları Pürindolin A'da yüksektir ve B. distachyon tohumları ve pirinç çekirdekleri ile karşılaştırıldığında büyüktür. Bu tohumlar teleskop montajını kullanarak bölümleme yaparken sık sık ufalanır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Genotip</td>
			<td>Teleskop montajı kullanılarak ortalama kesit genişliği (μm)</td>
			<td>Ortalama kesit genişliği (μm) kesit serbest</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nipponbare (kabuklu)</td>
			<td>971,7 ± 152,4ab
</td>
			<td>1059.571 ± 394,2ab
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Xieyou 7954</td>
			<td>825.1 ± 128.3b
</td>
			<td>1306.187 ± 179,1a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>910,6 ± 165,0ab
</td>
			<td>1126.694 ± 395,3ab
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">P < 0.01'de varyans (ANOVA) ve Tukey'in testinin (n = 10) tek yönlü analizi kullanılarak aynı harflerin izlediği araçlar önemli ölçüde farklı değildir. İstatistiksel analizler JMP 15 yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Ortalama çekirdek kesit kalınlığı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Genotip</td>
			<td>Ortalama süre (ler)*</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nipponbare (kabuklu)</td>
			<td>14.7 ± 1.36a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Xieyou 7954</td>
			<td>9,81 ± 0,98b
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>11,9 ± 1,28c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">*Teleskop montajını kullanarak.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">P < 0.01'de varyans (ANOVA) ve Tukey'in testinin (n = 10) tek yönlü analizi kullanılarak aynı harflerin izlediği araçlar önemli ölçüde farklı değildir. İstatistiksel analizler JMP 15 yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Ortalama numune hazırlama süresi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Genotip</td>
			<td>Arka plan</td>
			<td>Nitelik</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nipponbare</td>
			<td>Vahşi tür</td>
			<td>Saydam</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Standart altı nişast tanesi1 (ssg1)</td>
			<td>Nipponbare</td>
			<td>Kireçli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dayanıklı Nişast (RS) Xieyou 7954</td>
			<td>Vahşi tür</td>
			<td>Saydam</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS111</td>
			<td>Xieyou 7954</td>
			<td>Saydam</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>RS111</td>
			<td>Kireçli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yi-Tang, 'Yeni Hayat', Lujuren markası</td>
			<td>Xieyou 7954</td>
			<td>Kireçli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Xiushui 11</td>
			<td>Vahşi tür</td>
			<td>Saydam</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kemingdao1 (KMD1)</td>
			<td>Xiushui 11</td>
			<td>Saydam</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Bu çalışmada incelenen pirinç genotipleri.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig01.jpg"> Şekil 1: Enine pirinç bölümlerinin hazırlanması. (A) Sağlam kabuklu vahşi tip Nipponbare çekirdeği. (B). Düz dört inç çapında kauçuk durdurucu üzerine yerleştirilmiş çekirdek. (C) İki apposing kauçuk durdurucu arasında çekirdek öğütülerek kabukları çıkarıldı. (D) Kabuğu pirinç çekirdeğinden ayrılmıştır. (E) Kabuklu pirinç çekirdeğinin yakın çekimi. Embriyo ucu belirtilmiştir. (F) Çekirdeğin ince ön ayaklar kullanılarak pipet ucuna yerleştirilmesi. (G) Çekirdek pipet ucunun distal ucuna saplandı. (H) Kesitleme için çekirdeği hareketsiz hale getirmek için ikinci pipet ucunun yerleştirilmesi ('teleskop' montajı). (I) Pirinç çekirdeği pipet ucunun distal ucuna sıkıca monte edildi. (J) Pirinç çekirdeğinin montaj içinde bölümlenerek. (K) Kesit kesiminin yakın çekimi. (L) Çekirdeğin plastik annulus ile çevrelenmiş bir bölümü. (M) Enine bölümün yakın çekimi. (N) Nipponbare vahşi tipte enine bölüm. (O) Vahşi tip Nipponbare bölümünde endosperm yakın çekim. (P) Vahşi tip Nipponbare çekirdeğinin zayıf, yetersiz bölümü. (S) Nipponbare mutant ssg14'ünenine bölümü . (R) SSG1 bölümündeki endosperm yakın çekim. (S) Ssg1'inzayıf, yetersiz bölümü . Çubuk (paneller A, N-S) = 1 mm. Tüm pirinç çekirdeği ve bölümleri, dijital zum kamerası ve bektaşi ışıkları ile stereomikroskop kullanılarak görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig02.jpg"> Şekil 2: Enine çekirdek bölümlerinin SEM görüntüleri. (A) Vahşi tip Nipponbare, yarı saydam bir kültivar. Bileşik nişaste granülleri birbirine sıkıca çimentolandı; (B) Nipponbare mutant ssg14, tebeşirli bir fenotip. Bileşik nişasta granülleri gevşek bir şekilde paketlenmiştir ve vahşi tip Nipponbare nişasta morfotipinin çimentolu doğasından yoksundu. Soldan sağa büyütme: 260x, 920x ve 4200x. Çubuk uzunluğu panellerde belirtilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig03.jpg"> Şekil 3: Xiushui 11'in enine çekirdek bölümünün SEM mikroskobik anatomisi. (A) Tek bir endosperm hücresi kırmızı ile özetlenmiştir. 260x büyütme. (B) Bileşik nişasta granül kırmızı ile özetlenmiştir. 920x büyütme. (C) Birden fazla nişasta altgranules kırmızı ile özetlenmiştir. 2250x büyütme. Çubuk uzunlukları panellerde belirtilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Şekil S1: Bu teknik kullanılarak SEM için hazırlanan diğer pirinç genotiplerinin enine bölümleri. (A) Dayanıklı Nişaste (RS) Xieyou 795412. (B) RS111, 795413'lükyüksek RS şeffaf mutant . (C) RS4, RS11115tebeşirli mutant. (D) Yi-Tang, ticari bir yüksek amiloz pirinç çeşidi16. (E) Xiushui 11. (F) KMD1 (Kemingdao1)17,18,19. Parlak alan görüntüleri için 10x büyütme. Beyaz çubuk = SEM görüntüler için 1 mm. 2250x büyütme. Çubuk uzunlukları panellerde belirtilir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407supfig01.jpg" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S2: Teknik diğer tohumlar için yararlıdır. (A) Sahte mor bromun enine bölümü (Brachypodium distachyon L. katılım Bd21) tohumu. (B) Yumuşak beyaz kış buğdayının enine bölümü (Triticum aestivum L. cv. Augusta) tohumu. Parlak alan, 20 kat büyütme. Bar = 1 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407supfig02.jpg" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support at JoVE.com

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Bu protokol, taramalı elektron mikroskopisi kullanılarak endosperm ve nişaste granül morfolojisinin analizi için tahıl tohumlarının enine bölümlerinin (örneğin pirinç) hazırlanmasına izin verir.

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Bu protokol, tohumların parçalanmaması için sağlam bir şekilde dilimlenmesine izin verir ve pipet ucuna sığabilecek herhangi bir tohumdaki nişasta granüllerinin görselleştirilmesine izin verir. Dövülebilir plastik koni kuru doku ve organların doğal yapısını destekler, bu nedenle bu ucuz ve kolay manifold birçok numunenin kısa sürede işlenmesini sağlar. Buradaki adli mikroskopi avantajından devam etmek için, dirençli nişasta, hepimizin aradığı bir şey, enzimlerin ham nişastaya, amilolize, glisemik indekse ve glikoz artışlarına erişilebilirliği, bunlar bugün dünya çapında Tip 2 diyabetle savaşmak için daha iyi pirinç çeşitleri yetiştirmek için temel parametrelerdir.Ve şimdi size Dr. Kiah Barton'ı tanıtmak büyük bir zevk. Dr. Barton bizim laboratuvarımızdan ve bu tekniğin nasıl kullanıldığını göstermek için fakültenin çekirdek görüntüleme tesisini kullanacak. Kuru çekirdekleri kabuklarından arındırarak başlayın.Bir çalışma tezgahındaki düz bir kauçuk stoperin üzerine tek bir çekirdek yerleştirin ve bu stoperin sabit kaldığından emin olun. Çekirdeği ilk kauçuk durdurucuya doğru bükerek aşındırmak için ikinci bir düz kauçuk durdurucu kullanın, ardından çekirdekteki kabukları çıkarın, endospermi parçalamamaya veya tohumları iki kauçuk maşa arasında çok agresif bir şekilde öğütmemeye dikkat edin. İnce tokmaklar kullanarak kalan kabukları çıkarın ve plastik 250 mikroliter pipet ucuna tek bir kabuklu çekirdek yerleştirin.Çekirdeğin embriyo ucunun pipet ucunun konik ucuna doğru dönük olduğundan emin olun. Çekirdeği ilk pipet ucuna zorlamak ve kesit sırasında çekirdeği hareketsiz tutmak için ikinci bir 250 mikroliter pipet ucu yerleştirin, çekirdeğe zarar vermemeye veya ikinci pipet ucunu bükmemeye dikkat edin. Pipet ucu montajını bir tezgah üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve elle yerinde tutun.Öte yandan, çekirdeğin merkezini dilimlemek için keskin bir neşter bıçağı kullanın ve pipet ucunun ucunu kesin. Montaj boyunca aşağı doğru dilimleyin ve ardından neşter bıçağını dikey olarak yönlendirin, böylece el bölümünün iki yeni açık yüzü paraleldir. Daha sonra neşteri pirinç çekirdeğinin bir milimetre kalınlığında bölümlerini kesmek için kullanın.Yansıyan hafif mikroskopiyi gerçekleştirmek için, enine pirinç bölümlerini bir parça ağır kalibreli siyah kağıda yerleştirin. En az 10 kat büyütme kullanarak eğik aydınlatma için monte kaz tüyüne sahip stereo mikroskop kullanarak enine bölümlerin hafif görüntülerini elde edin. Vahşi tip Nipponbare ve ssg1 bölümleri 260 kez, 920 kez ve 4.200 kat büyütme altında incelendi.Düzgün bir şekilde hazırlandığında, pirinç bölümleri yaklaşık 0,9 milimetre kalınlığındaydı ve endosperm ve sağlam perikarp ve aleuron katmanlarının minimum parçalanmasıyla. Bu teknik, tüm endosperm hücresini, bileşik nişaste granüllerini ve bireysel granülleri gözlemlemek için yeterli kalitede bölümlerin hazırlanmasını sağlar. Vahşi tip dirençli nişasta hibrid hattı, Zhehui 7954 ve kobalt üretilen mutant RS111 gibi yarı saydam çekirdek üreticileri, normal pirinç endosperm fenotipi olan sıkıca paketlenmiş polihedral nişasta granülleri ürettiler.Tebeşirli çekirdek üreticilerinin SEM görüntüleri, ticari çeşitlilik Ye Tang ve RS4, yuvarlak ve gevşek bir şekilde paketlenmiş nişasta granüllerini sergiledi. Vahşi tip Xiushiu 11 ve böcek predasyonunu inhibe etmek için Cry1Ab genini ifade eden mutant KMD1, yarı saydam dirençli nişasta çizgilerine benzer bölümlere ve endosperm morfotiplerine sahipti. Bu teknik diğer türlerin tohumlarına uygulanabilir.Model monocot, Brachypodium distachyon, çok sert tohumlar üretir, ancak yine de sağlam bir enine bölüm elde etmek mümkündü. Bozulmamış enine bölümler de yumuşak, beyaz kış buğdayından üretildi. Biyolojik yapıların içine bakmak için bu hızlı, ucuz tarama yöntemi böcek bacaklarına, çekirge fasulyesi ağacı başaklarına, alıçlara, balık dikenlerine veya bu örnek destek kurulumundan kar edebilecek herhangi bir adli mikroskopi alanına uygulanabilir.Bu protokolü gerçekleştirdikten sonra elektromikroskop için sputter kaplama, spesifik floresan boyalarla boyama ve mutant yulaf ve arpa hatlarında beta glukan hücre duvar kalınlığı için calcafluor'un lekeye uygulanması, hızlı fenotip taraması ile bitki ıslahı yaklaşmanın bazı hızlı yollarıdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties Lactuca sativa L. and Crop Wild Relatives Lactuca spp.

Marul Çeşitleri C Vitamini Quantification için Geliştirilmiş UPLC-UV Yöntemi(Lactuca sativa L.) ve Crop Wild Relatives(Lactuca spp.)

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Destek Yüzdürme Bloğu Kullanılarak İletim Elektron Mikroskopisinde Numune Destek Filmlerinin Hazırlanması

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...