Name: use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

نشكر الدكتور غاري بانكر على اقتراحه بشأن بروتوكول ثقافة الخلايا العصبية. ويدعم هذا العمل معهد هوارد هيوز الطبي، وهو منحة من المعاهد القومية للصحة، وهبت جورج بارث جيلر الأستاذية (V.B.

ملاحظة: يتم تكييف هذه الطريقة ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر من بعد الولادة 0-يوم ANK3-E22/23و / و الفئران من غاري بانكر في غليا / الخلايا العصبية نظام الثقافة المشتركة. لذلك، من المهم جدا تنفيذ جميع الخطوات بعد تشريح غطاء محرك السيارة باستخدام أدوات معقمة. يستغرق هذا البروتوكول شهرا....

<ol>
	<li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP.">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li><li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors.">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li><li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM.">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li><li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex.">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).</li><li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development.">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li><li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+activity+regulates+Na(+)+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment.">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability.">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li><li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon.">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li><li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Made+for+"anchorin":+Kv7.2/7.3+(KCNQ2/KCNQ3)+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons.">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing.">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li><li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier.">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G:+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling.">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin.">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment.">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly.">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li></ol>

يتم تنظيم جمعية AIS من قبل 480 kDa ankyrin-G. ومع ذلك، أنكيرين-G لديه isoforms أقصر التي يمكن أن تستهدف AIS من الخلايا العصبية البرية، والتي قد تؤدي إلى صعوبة في تفسير تحليلات هيكل وظيفة التجمع AIS. هنا نقدم طريقة باستخدام الخلايا العصبية من ANK3-E22/23-flox الفئران التي تسمح لدراسة الجمعية دي نوفو من AIS. ?...

يقع الجزء الأولي من المحور عند المحور القريب في معظم الخلايا العصبية الفقارية. من الناحية الوظيفية ، AIS هو المكان الذي يتم فيه بدء إمكانات العمل بسبب الكثافة العالية لقنوات الصوديوم ذات بوابات الجهد في هذه المنطقة. AIS من بعض الخلايا العصبية مثيرة وتستهدف أيضا من قبل interneurons المثبطة من خلال تشكيل نقاط الاشتباك العصبي GABAergic1,2,3. لذلك ، AIS هو موقع حاسم لدمج إشارات الخلايا وتعديل استثارة الخلايا العصبية. AIS هو عادة 20-60 ميكرومتر في الطول وتقع ضمن 20 ميكرومتر من جسم الخلية. طول وموقف AIS يختلف في الخلايا العصبية عبر مناطق الدماغ, وكذلك في مراحل النمو المختلفة من نفس الخلايا العصبية4,5. وتشير الأدلة المتراكمة إلى أن تكوين وموقع AIS ديناميكية في الاستجابة لتغير نشاط الخلايا العصبية4و5و6و7.
480 kDa ankyrin-G هو المنظم الرئيسي ل AIS. 480 kDa ankyrin-G هو بروتين محول مرتبط بالغشاء يرتبط مباشرة بقنوات الصوديوم المسورة بالجهد وكذلك بروتينات AIS الرئيسية الأخرى بما في ذلك beta4-spectrin و KCNQ2/3 القنوات التي تعدل نشاط قناة الصوديوم8و9و 186 kDa neurofascin ، وهو L1CAM يوجه نقاط الاشتباك العصبي GABAergic إلى AIS2،10. 480 kDa ankyrin-G أسهم المجالات الكنسي ankyrin وجدت في قصيرة 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK يكرر, المجال ملزمة spectrin, المجال التنظيمي), ولكن تتميز exon العملاقة التي توجد فقط في الفقاريات ويتم التعبير عنها على وجه التحديد في الخلايا العصبية (الشكل 1A)11,12. ال 480 kDa ankyrin-G مجال الخلايا العصبية محددة (NSD) مطلوب لتشكيل AIS12. و190 kDa ankyrin-G لا يعزز AIS التجمع أو الهدف AIS في الخلايا العصبية ankyrin-G-null12. ومع ذلك، 190 كدا ankyrin-G يتركز في AIS تحتوي على 480 kDa ankyrin-G12. هذه القدرة من 190 kDa ankyrin-G لاستهداف AIS تجميعها مسبقا من الخلايا العصبية البرية كان مصدرا للارتباك في الأدب وأبطأت تقدير الوظائف المتخصصة الحرجة من 480 kDa ankyrin-G في جمعية AIS. لذلك، فمن الأهمية بمكان لدراسة الجمعية AIS في الخلايا العصبية ankyrin-G-null التي تفتقر إلى AIS تجميعها مسبقا.
هنا، نقدم طريقة لدراسة تجميع وهيكل AIS باستخدام الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة من ANK3-E22/23-flox الفئران التي تقضي على جميع isoforms من ankyrin-G13 (الشكل 1B). عن طريق تحويل الخلايا العصبية مع بناء Cre-BFP قبل أن يتم تجميع AIS، قمنا بتوليد الخلايا العصبية ankyrin-G-ناقص تفتقر تماما إلى AIS (الشكل 1B، الشكل 2). يتم إنقاذ تجميع AIS بالكامل بعد المشاركة في إعادة العدوى من 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid مع بلازميد Cre-BFP. يوفر هذا الأسلوب طريقة لدراسة تجميع AIS في بيئة AIS غير تجميعها مسبقا. كما قمنا بتعديل نظام الثقافة المشتركة بين الخلايا العصبية من غاري بانكر دون استخدام المضادات الحيوية ، المصممة سابقا للخلايا العصبية الجنينية في اليوم 18 ، لتطبيقها على الخلايا العصبية الماوس بعد الولادة وتكييفها طريقة كمية AIS لمتوسط قياسات AIS من الخلايا العصبية المتعددة لتطبيع الاختلاف من AIS14،15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18mm coverglass (1.5D)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-84-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#31059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Tripsin without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>480kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>lab made</td>
			<td>Provide upon request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANK3-E22/23f/f mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>Stock No: 029797</td>
			<td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer with 70-mm mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic coverslip-staining rack</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-BFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#128174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM with Earle&#8217;s salts and L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 70%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>225711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26124-78-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments

الأجزاء الأولية المحورية العصبية (AIS) هي مواقع لبدء إمكانات العمل وقد تمت دراستها على نطاق واسع لهيكلها الجزيئي وتجميعها ولدونتها المعتمدة على النشاط. العملاقة ankyrin-G، المنظم الرئيسي لل AIS، يرتبط مباشرة مع غشاء تمتد الجهد الصوديوم مسور (VSVG) وقنوات البوتاسيوم (KCNQ2/3)، فضلا عن 186 kDa neurofascin، جزيء الالتصاق الخلية L1CAM. العملاقة ankyrin-G يربط أيضا إلى ويجند جزيئات AIS السيتوبلازمية بما في ذلك بيتا-4-سبيكترين, والبروتينات microtubule ملزمة, EB1/EB3 و Ndel1. العملاقة ankyrin-G كافية لانقاذ تشكيل AIS في الخلايا العصبية نقص ankyrin-G. Ankyrin-G يشمل أيضا أصغر 190 kDa isoform تقع في العمود الفقري dendritic بدلا من AIS, التي هي غير قادرة على استهداف AIS أو إنقاذ AIS في الخلايا العصبية أنكيرين-G-ناقصة. هنا، وصفنا بروتوكول باستخدام الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة من ANK3-E22/23-flox الفئران، والتي، عندما transfected مع فقدان المعرض Cre-BFP من جميع isoform من الأنكيرين-G وإضعاف تشكيل AIS. الجمع بين تعديل بانكر غليا / الخلايا العصبية نظام الثقافة المشتركة، وضعنا طريقة لtransfect ankyrin-G الخلايا العصبية فارغة مع 480 kDa ankyrin-G-GFP البلازميد، وهو ما يكفي لإنقاذ تشكيل AIS. نحن نستخدم أيضا طريقة القياس الكمي، التي وضعتها سالزر وزملاؤه للتعامل مع الاختلاف في مسافة AIS من أجسام الخلايا العصبية التي تحدث في ثقافات الخلايا العصبية فرس النهر. يسمح هذا البروتوكول بإجراء دراسات كمية لتجميع دي نوفو والسلوك الديناميكي ل AIS.

وينبغي أن تشمل مجموعة كاملة من التجربة Cre-BFP transfection فقط كتحكم سلبي، Cre-BFP بالإضافة إلى 480 kDa ankyrin-G المشارك transfection كتحكم إيجابي وحالة غير مصابة كتحكم تقني. في التحكم فقط في Cre-BFP ، تفتقر الخلايا العصبية المصابة إلى تراكم علامات AIS ، بما في ذلك ankyrin-G (ankG) وبيتا4-سبيكترين (β4) و neurofascin (Nf) وقنوات الصوديو...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

هنا، وصفنا بروتوكول لدراسة كميا تجميع وهيكل الأجزاء الأولية محور عصبي (AIS) من الخلايا العصبية فرس النهر التي تفتقر إلى AIS تجميعها مسبقا بسبب عدم وجود عملاقة أنكيرين-G.

استخدام الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة الأولية لدراسة تجميع الأجزاء الأولية أكسون

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

يستخدم هذا البروتوكول لدراسة تجميع وهيكل الأجزاء الأولية من الخلايا العصبية فرس النهر التي تفتقر إلى AIS تجميعها مسبقا بسبب عدم وجود ankyrin-G العملاقة. للبدء، تشريح ستة إلى ثمانية فرس النهر من مرحلة ما بعد الولادة، يوم واحد الجراء القديمة مع HBSS المتوسطة في طبق بيتري. فرم فرس النهر مع مقص تشريح إلى قطع أصغر، ونقلها من الطبق إلى أنبوب 15 ملليلتر.غسل فرس النهر مرتين مع خمسة ملليلتر من HBSS، وتركها في 4.5 ملليلتر من HBSS بعد الغسيل. إضافة 0.5 ملليلتر من 2.5٪ تريبسين إلى 4.5 ملليلتر من HBSS، واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، عكس الأنبوب كل خمس دقائق. وينبغي أن تصبح فرس النهر هضمها جيدا لزجة وتشكيل مجموعة.إذا لزم الأمر، تمديد الهضم لمدة خمس دقائق أخرى. غسل فرس النهر مع HBSS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل. بعد الغسيل، إضافة اثنين من ملليلتر من HBSS وماصة فرس النهر صعودا وهبوطا مع ماصة باستور 15 مرة.تريتور الأنسجة مع ماصة باستور مصقول النار 10 مرات، وبقية الأنبوب لمدة خمس دقائق حتى جميع القطع تعيين إلى أسفل. كرر التريتوريشن مع القطع المتبقية حتى يختفي معظمها. ثم، استخدم طرف ماصة ملليلتر واحد لنقل الناتشرات الفائق الذي يحتوي على الخلايا العصبية المفككة برفق إلى أطباق الطلاء.إضافته مباشرة إلى المتوسط الطلاء قبل احتضان ويهز لوحة بلطف. بعد ساعتين إلى أربع ساعات من البذر، تحقق من أطباق الطلاء بالمجهر الخفيف. غالبية الخلايا العصبية يجب أن تعلق على زلة الغطاء.باستخدام ملقط طرف غرامة، والوجه الغطاء ينزلق إلى أطباق التغذية الخلية الدبقية التي تحتوي على المتوسطة ثقافة الخلايا العصبية مسبقا مع الجانب نقاط الشمع التي تواجه إلى أسفل. يمكن أن تنمو الخلايا العصبية في أطباق التغذية بالخلايا الدبقية لمدة تصل إلى شهر واحد. تغذية الخلايا العصبية كل سبعة أيام مع ملليلتر واحد من الخلايا العصبية الطازجة ثقافة المتوسطة.في اليوم الثالث في المختبر، والوجه زلات الغطاء مع الجانب نقطة الشمع التي تواجه ما يصل الى طبق تغذية الخلايا الدبقية مع المتوسطة ثقافة الخلايا العصبية مشروطة. مزيج 0.25 ميكروغرام من الحمض النووي CRE BFP مع 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي أنكيرين-G GFP في أنبوب 1.7 ملليلتر لtransfect أربع زلات الغطاء. أضف 100 ميكرولتر الأمثل.ثم خلط الأنبوب ويستريح على رف. إذا تم تحويل CRE BFP فقط ، يتم استخدام العمود الفقري البلازمي GFP لمطابقة الكمية الإجمالية للحمض النووي. امزج ثلاثة ميكرولترات من كاشف العدوى مع 100 ميكرولتر من الأمثل في أنبوب جديد 1.7 ملليلتر واحتضان الأنبوب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.ثم، مزيج 100 ميكرولتر من الحمض النووي مختلطة سابقا مع 100 ميكرولتر من مزيج كاشف العدوى، وترك الأمر لمدة خمس إلى 10 دقائق على رف. أضف 50 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي فوق كل زلة غطاء عن طريق إدخال الطرف أسفل الوسط مباشرة دون لمس زلات الغطاء. ماصة ببطء لتجنب نشر مزيج الحمض النووي.أحضر الطبق ببطء إلى الحاضنة واتركه هناك لمدة 30 إلى 45 دقيقة. الوجه الغطاء ينزلق مرة أخرى إلى طبق التغذية glial المنزل مع الجانب نقطة الشمع التي تواجه أسفل ووضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة. بالنسبة للقياس الكمي ل AIS، افتح صور السلسلة Z في فيجي وولد أقصى عرض للصور.بعد طرح إشارة خلفية زلة الغطاء الفارغة من الصورة، ارسم خطا على طول AIS، مع التأكد من أن عرض الخط يغطي AIS بالكامل. بدء تشغيل الخط قبل رفع إشارة AIS فوق الخلفية وإيقاف بعد أن يسقط إلى الخلفية. قم بقياس متوسط كثافة البكسل على طول الخط، ثم قم بتصديره إلى جدول بيانات.ثم قم بتشغيل برنامج نصي MATLAB لإنشاء الرقم النهائي. وينبغي أن تشمل التجربة Cre-BFP فقط transfection كتحكم سلبي، وكري BFP بالإضافة إلى 480 كيلودالتون أنكيرين-G cotransfection كتحكم إيجابي، وحالة غير مصابة كتحكم تقنية. في التحكم فقط في Cre-BFP ، تفتقر الخلايا العصبية المصابة إلى تراكم علامات AIS ، بما في ذلك ankyrin-G و Beta 4 spectrin و neurofascin وقنوات الصوديوم المسورة بالجهد.في المقابل، قامت الخلايا العصبية المشتركة بين كري و480 كيلودالتون أنكيرين-جي بتجميع AIS بالكامل، وهو ما يتضح من وجود علامات AIS. من المهم التأكد من جودة الثقافة من خلال المقارنة مع الأطباق غير المصابة. الخلايا العصبية غير الصحية تميل إلى إظهار بنية AIS غير طبيعية، مثل AIS توقف أو خارج الرحم.لتقييم كيفية تأثير طفرة اضطراب النمو العصبي البشري ankyrin-G على تجميع AIS ، تم رسم متوسط كثافة AIS من السمية إلى المحور البعيدة. تظهر البروتينات المخصبة AIS عادة زيادة سريعة في الإشارة من المحور القريب وانخفاض بطيء في الإشارة إلى المحور المحوري البعيدة. عندما تتماشى مع AIS غير المصابة، منحنى متحولة أوسع وذروة المنحنى هو أقل، مما يشير إلى تغيير هيكل AIS.نوع البرية ankyrin-G تجميع AIS محاذاة بشكل وثيق مع واحد غير المصابة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection والثقافة الأولية من الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

مضان الانتعاش بعد Photobleaching (FRAP) من البروتينات المرتبطة دلاليا الإسفار في العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الحصين مثقف

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

دراسة وراثية من التجديد أكسون مع الكبار الظهرية مثقف الخلايا العصبية العقدة الجذر

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

الكشف عن بروتين Palmitoylation في الخلايا العصبية قرن آمون بواسطة مثقف مناعي والبورصات الأسيل، البيوتين (آبي)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

استخدام pHluorin لتقييم ديناميات مستقبلات الإرشاد أكسون في زراعة الخلايا وفي الجنين الفرخ

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

التصوير شجيري العمود الفقري من الفئران الابتدائية الحصين الخلايا العصبية باستخدام منظم الإضاءة المجهر

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...