Name: use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

Vi takker Dr. Gary Banker for forslag om neuronal kultur protokol. Dette arbejde er støttet af Howard Hughes Medical Institute, et tilskud fra NIH, og en George Barth Geller begavet professorat (V.B.).

BEMÆRK: Denne kultur metode hippocampal neuroner fra postnatal 0-dages ANK3-E22/23f / f mus er tilpasset fra Gary Banker's glia / neuron co-kultur system. Derfor er det vigtigt at udføre alle trin efter dissektion i en ren hætte ved hjælp af steriliseret værktøj. Denne protokol tager op til 1 måned. Arbejdsprocessen vises i Figur 3. Protokollen følger Duke Universitys retningslinjer for dyr.
1. Tilberedning af coverslips og neuronale pla...

<ol>
	<li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP.">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li><li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors.">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li><li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM.">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li><li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex.">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).</li><li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development.">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li><li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+activity+regulates+Na(+)+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment.">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability.">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li><li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon.">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li><li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Made+for+"anchorin":+Kv7.2/7.3+(KCNQ2/KCNQ3)+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons.">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing.">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li><li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier.">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G:+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling.">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin.">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment.">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly.">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li></ol>

Samlingen af AIS er organiseret af 480 kDa ankyrin-G. Ankyrin-G har dog kortere isoformer, der kan målrettes mod AIS af wildtype neuroner, hvilket kan føre til vanskeligheder med fortolkning af strukturfunktionsanalyser af AIS-samling. Her præsenterer vi en metode ved hjælp af neuroner fra ANK3-E22/23-flox mus, der gør det muligt at studere de novo samling af AIS. Ved at transfectere med Cre-BFP ved 3 div eliminerer vi alle endogene isoformer af ankyrin-G. Vi kunne også co-transfect 480 kDa ankyri...

Axon indledende segment er placeret på den proksimale axon i de fleste hvirveldyr neuroner. Funktionelt er AIS, hvor handlingspotentialer indledes på grund af den høje tæthed af spændings-gated natriumkanaler i denne region. AIS af nogle excitatoriske neuroner er også målrettet mod hæmmende interneuroner ved at danne GABAergic synapser1,2,3. Derfor er AIS et kritisk sted at integrere cellesignalering og modulere neuronernes excitabilitet. AIS er normalt 20-60 μm i længden og placeret inden for 20 μm af cellekroppen. Længden og placeringen af AIS varierer i neuroner på tværs af hjerneregioner såvel som i forskellige udviklingsstadier af samme neuron4,5. Akkumuleret dokumentation tyder på , at AIS' sammensætning og position er dynamisk til at reagere på ændringen af neuronal aktivitet4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G er hovedarrangør af AIS. 480 kDa ankyrin-G er et membran associeret adapterprotein, der direkte binder sig til spændingsporterede natriumkanaler samt andre større AIS-proteiner, herunder beta4-spectrin, KCNQ2/3-kanaler, der modulerer natriumkanalaktivitet8,9og 186 kDa neurofascin, et L1CAM, der dirigerer GABAergic synapser til AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G aksjer kanoniske ankyrin domæner findes i den korte 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK gentager, spectrin bindende domæne, regulerende domæne), men er kendetegnet ved en kæmpe exon, der findes kun i hvirveldyr og er specifikt udtrykt i neuroner (Figur 1A)11,12. Det 480 kDa ankyrin-G neuron specifikke domæne (NSD) er påkrævet for AISformation 12. Den 190 kDa ankyrin-G fremmer ikke AIS forsamling eller mål AIS i ankyrin-G-null neuroner12. 190 kDa ankyrin-G er dog koncentreret på AIS, der indeholder 480 kDa ankyrin-G12. Denne evne til 190 kDa ankyrin-G til at målrette formonteret AIS af wildtype neuroner har været en kilde til forvirring i litteraturen og har bremset forståelsen af de kritiske specialiserede funktioner i 480 kDa ankyrin-G i AIS forsamling. Derfor er det vigtigt at studere AIS-samling i ankyrin-G-null neuroner, der mangler en formonteret AIS.
Her præsenterer vi en metode til at studere AIS's samling og struktur ved hjælp af dyrkede hippocampale neuroner fra ANK3-E22/23-flox mus, der eliminerer alle isoformer af ankyrin-G13 (Figur 1B). Ved at transfektere neuroner med en Cre-BFP-konstruktion, før AIS samles, genererede vi ankyrin-G-mangelfulde neuroner, der helt manglede en AIS (Figur 1B, Figur 2). Samlingen af AIS er fuldt reddet efter co-transfection af 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid med en Cre-BFP plasmid. Denne metode gør det at studere AIS-samlingen i et ikke-formonteret AIS-miljø. Vi har også ændret glia-neuron co-kultur system fra Gary Banker uden at bruge antibiotika, tidligere designet til embryonale dag 18 neuroner, til anvendelse til postnatal mus neuroner og tilpasset en AIS quantitation metode til gennemsnitlige AIS målinger fra flere neuroner til at normalisere variationen af AIS14,15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18mm coverglass (1.5D)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-84-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#31059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Tripsin without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>480kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>lab made</td>
			<td>Provide upon request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANK3-E22/23f/f mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>Stock No: 029797</td>
			<td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer with 70-mm mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic coverslip-staining rack</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-BFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#128174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM with Earle&#8217;s salts and L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 70%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>225711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26124-78-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments

Neuronal axon indledende segmenter (AIS) er steder for indledning af handling potentialer og er blevet grundigt undersøgt for deres molekylære struktur, samling og aktivitet-afhængige plasticitet. Giant ankyrin-G, master arrangør af AIS, direkte forbinder med membran-spænder spænding gated natrium (VSVG) og kalium kanaler (KCNQ2/3), samt 186 kDa neurofascin, en L1CAM celle vedhæftning molekyle. Giant ankyrin-G binder sig også til og rekrutterer cytoplasmiske AIS molekyler, herunder beta-4-spectrin, og mikrotubule-bindende proteiner, EB1/EB3 og Ndel1. Giant ankyrin-G er tilstrækkelig til at redde AIS dannelse i ankyrin-G mangelfuld neuroner. Ankyrin-G indeholder også en mindre 190 kDa isoform placeret ved dendritiske rygsøjler i stedet for AIS, som er ude af stand til at målrette mod AIS eller redde AIS i ankyrin-G-mangelfuld neuroner. Her beskrev vi en protokol ved hjælp af dyrkede hippocampale neuroner fra ANK3-E22/23-flox mus, som, når de transfected med Cre-BFP udviser tab af alle isoform af ankyrin-G og forringe dannelsen af AIS. Kombineret en modificeret Banker glia / neuron co-kultur system, vi udviklet en metode til at transfekt ankyrin-G null neuroner med en 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, hvilket er tilstrækkeligt til at redde dannelsen af AIS. Vi anvender desuden en kvantificeringsmetode, udviklet af Salzer og kolleger til at håndtere variation i AIS afstand fra de neuronale cellelegemer, der forekommer i hippocampale neuronkulturer. Denne protokol tillader kvantitative undersøgelser af de novo-samlingen og AIS's dynamiske adfærd.

Et komplet sæt af eksperiment bør omfatte Cre-BFP kun transfekt som negativ kontrol, Cre-BFP plus 480 kDa ankyrin-G co-transfection som positiv kontrol og en ikke-transfected tilstand som teknik kontrol. I Cre-BFP mangler transfected neuroner kun akkumulering af AIS-markører, herunder ankyrin-G (ankG), beta4-spectrin (β4), neurofascin (Nf) og spænding gated natriumkanaler (VSVG) (Figur 4A)16. I modsætning hertil har Cre og 480 kDa ankyrin-G co-transfected neuron...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Her beskrev vi en protokol til kvantitativt at studere samlingen og strukturen af axon indledende segmenter (AIS) af hippocampal neuroner, der mangler formonteret AIS på grund af fraværet af en kæmpe ankyrin-G.

Brug af primære kulturperler Hippocampal Neuroner til at studere forsamlingen af Axon indledende segmenter

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Denne protokol bruges til kvantitativt at studere samlingen og strukturen af axon indledende segmenter af Hippocampal Neurons, der mangler formonteret AIS på grund af fraværet af en kæmpe ankyrin-G. Til at begynde med dissekere seks til otte hippocampi fra postnatal, en dag gamle hvalpe med HBSS medium i en petriskål. Hak hippocampi med dissektion saks i mindre stykker, og overføre dem fra fadet til en 15 milliliter rør.Vask hippocampi to gange med fem milliliter HBSS, og lad dem i 4,5 milliliter HBSS efter vask. Tilsæt 0,5 milliliter 2,5% trypsin i 4,5 milliliter HBSS, og inkuber i et 37 grader Celsius vandbad i 15 minutter, invertere røret hvert femte minut. Godt fordøjet hippocampi skal blive klæbrig og danne en klynge.Hvis det er nødvendigt, skal fordøjelsen forlænges med yderligere fem minutter. Vask hippocampi med HBSS tre gange i fem minutter pr. Vask. Efter vask, tilsæt to milliliter HBSS og pipette hippocampi op og ned med en Pasteur pipette 15 gange.Triturat vævet med en brandpoleret Pasteur pipette 10 gange, og hvile røret i fem minutter, indtil alle bidder sat til bunden. Gentag triturationen med de resterende stykker, indtil de fleste af dem er forsvundet. Brug derefter en en milliliter pipettespids til forsigtigt at overføre supernatanten, der indeholder de dissociated neuroner, til plating retter.Tilsæt det direkte til det forinkuberede plating medium og ryst pladen forsigtigt. To til fire timer efter såning skal du kontrollere plating retterne med et let mikroskop. De fleste af neuronerne burde have fastgjort til dækslet.Ved hjælp af en fin spids pincet, flip dækslet glider til glial celle feeder retter, der indeholder forkonditioneret neuronal kultur medium med voks prikker side vender nedad. Neuroner kan vokse i glial celle feeder retter i op til en måned. Foder neuroner hver syvende dag med en milliliter frisk neuronal kultur medium.På den tredje dag in vitro, flip dækslet glider med voks prik side vender op i en glial celle feeder parabol med konditioneret neuronal kultur medium. Bland 0,25 mikrogram CRE BFP DNA med 0,5 mikrogram ankyrin-G GFP DNA i et 1,7 milliliter rør for at transfektere fire dæksedler. Tilsæt 100 mikroliter optimalt.Bland derefter røret og hvilede på et stativ. Hvis kun CRE BFP transfected, GFP plasmic rygraden bruges til at matche den samlede mængde DNA. Bland tre mikroliter transfekturereagens med 100 mikroliter optimalt i et nyt 1,7 milliliter rør og inkuber røret i fem minutter ved stuetemperatur.Bland derefter 100 mikroliter af det tidligere blandede DNA med 100 mikroliter transfektreagensblanding, og lad det stå i fem til 10 minutter på et stativ. Tilsæt 50 mikroliter af DNA-blandingen oven på hver dæksedlen ved at indsætte spidsen lige under mediet uden at røre dækslet glider. Pipette langsomt for at undgå at sprede DNA-mix.Bring langsomt skålen tilbage til inkubatoren og lad den stå der i 30 til 45 minutter. Vend dækslet glider tilbage til hjemmet glial feeder parabol med voks prik side vender ned og sætte fadet tilbage i inkubatoren. For AIS kvantificering skal du åbne Z-seriens billeder i Fiji og generere en maksimal projektion af billeder.Når du har trukket det tomme dækslet slip baggrundssignal fra billedet, skal du tegne en linje langs AIS og sørge for, at bredden af linjen dækker AIS fuldt ud. Start linjen, før AIS-signalet hæves over baggrunden, og stop, når det falder til baggrunden. Mål den gennemsnitlige pixelintensitet langs linjen, og eksporter den til et regneark.Kør derefter et MATLAB-script for at generere det endelige tal. Forsøget bør omfatte Cre-BFP kun transfekt som negativ kontrol, Cre-BFP plus 480 kilodalton ankyrin-G cotransfection som positiv kontrol, og en ikke-transfected tilstand som teknik kontrol. I Cre-BFP kun kontrol, transfected neuroner mangler ophobning af AIS markører, herunder ankyrin-G, beta 4 spectrin, neurofascin, og spænding gated natrium kanaler.I modsætning hertil har Cre og 480 kilodalton ankyrin-G co-transfected neuroner fuldt samlet AIS, hvilket fremgår af tilstedeværelsen af AIS markører. Det er vigtigt at bekræfte kulturens kvalitet ved sammenligning med de ikke-transfected retter. Usunde neuroner tendens til at vise unormalE AIS struktur, som udgået eller ektopisk AIS.For at vurdere, hvordan en ankyrin-G human neuroudviklingsforstyrrelse mutation påvirker AIS samling, den gennemsnitlige AIS intensitet blev plottet fra soma til distal axon. AIS-berigede proteiner viser normalt en hurtig stigning i signalet fra den proksimale axon og et langsomt fald i signalet til distal axon. Når den er justeret med den ikke-transfected AIS, er den mutante kurve bredere, og kurvens top er lavere, hvilket tyder på en strukturændring af AIS.Den vilde type ankyrin-G samlet AIS tæt på linje med den ikke-transfected en.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk Undersøgelse af Axon Regeneration med dyrkede voksne dorsale rodganglie neuroner

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Påvisning af protein palmitoylering i dyrkede hippocampale neuroner ved immunopræcipitation og Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumphosphat Transfektion af primær hippocampusneuroner

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Brug af pHluorin til at vurdere dynamikken i Axon-vejledningsreceptorer i cellekultur og i chickembryoet

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritiske udløbere af Rat Primær hippocampusneuroner hjælp Structured Illumination Mikroskopi

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...