Name: use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

We danken Dr. Gary Banker voor suggestie over neuronaal cultuur protocol. Dit werk wordt ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute, een beurs van NIH, en een George Barth Geller begiftigd hoogleraarschap (V.B.).

OPMERKING: Deze kweekmethode van hippocampale neuronen van postnatale 0-daagse ANK3-E22/23f/f muizen is aangepast aan gary banker's glia/neuron co-cultuur systeem. Daarom is het van cruciaal belang om alle stappen na dissectie in een schone kap uit te voeren met behulp van gesteriliseerd gereedschap. Dit protocol duurt maximaal 1 maand. De werkstroom wordt weergegeven in figuur 3. Het protocol volgt de dierrichtlijnen van Duke University.
1. Het ...

<ol>
	<li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP.">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li><li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors.">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li><li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM.">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li><li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex.">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).</li><li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development.">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li><li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+activity+regulates+Na(+)+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment.">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability.">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li><li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon.">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li><li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Made+for+"anchorin":+Kv7.2/7.3+(KCNQ2/KCNQ3)+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons.">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing.">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li><li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier.">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G:+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling.">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin.">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment.">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly.">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li></ol>

De assemblage van AIS wordt georganiseerd door 480 kDa ankyrin-G. Ankyrine-G heeft echter kortere isovormen die zich kunnen richten op de AIS van wildtype neuronen, wat kan leiden tot problemen bij de interpretatie van structuurfunctieanalyses van AIS-assemblage. Hier presenteren we een methode met neuronen van ANK3-E22/23-flox muizen die studie van de novo assemblage van de AIS mogelijk maakt. Door te transfecteren met Cre-BFP op 3 div, elimineren we alle endogene isovormen van ankyrine-G. We kunnen oo...

Het axon initiële segment bevindt zich bij het proximale axon in de meeste gewervelde neuronen. Functioneel gezien is AIS waar actiepotentiaal wordt geïnitieerd vanwege de hoge dichtheid van spanningspoortnatriumkanalen in deze regio. AIS van sommige excitatory neuronen zijn ook gericht door remmende interneurons door het vormen van GABAergic synapsen1,2,3. Daarom is AIS een kritieke locatie om celsignalering te integreren en de prikkelbaarheid van neuronen te moduleren. AIS is normaal gesproken 20-60 μm lang en bevindt zich binnen 20 μm van het cellichaam. De lengte en positie van AIS varieert in neuronen in hersengebieden, evenals in verschillende ontwikkelingsstadia van hetzelfde neuron4,5. Geaccumuleerd bewijs suggereerde dat de samenstelling en positie van AIS dynamisch zijn in het reageren op de verandering van neuronale activiteit4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G is de hoofdorganisator van AIS. 480 kDa ankyrine-G is een membraan geassocieerd adaptereiwit dat zich direct bindt aan spanning gated natriumkanalen en andere belangrijke AIS-eiwitten, waaronder beta4-spectrin, KCNQ2/3 kanalen die natriumkanaalactiviteit8,9en 186 kDa neurofascine moduleren, een L1CAM die GABAergische synapsen naar de AIS2,10leidt . 480 kDa ankyrine-G deelt canonieke ankyrinedomeinen die te vinden zijn in de korte 190 kDa ankyrine-G isoform (ANK repeats, spectrin binding domain, regulatory domain), maar onderscheiden zich door een gigantische exon die alleen in gewervelde dieren voorkomt en specifiek wordt uitgedrukt in neuronen (Figuur 1A)11,12. Het 480 kDa ankyrine-G neuron specifiek domein (NSD) is vereist voor AIS-vorming12. De 190 kDa ankyrine-G bevordert geen AIS-assemblage of richt zich niet op AIS in ankyrine-G-null neuronen12. Echter, 190 kDa ankyrine-G is geconcentreerd op de AIS met 480 kDa ankyrine-G12. Dit vermogen van de 190 kDa ankyrine-G om zich te richten op voorgemonteerde AIS van wildtype neuronen is een bron van verwarring in de literatuur geweest en heeft de waardering van de kritische gespecialiseerde functies van de 480 kDa ankyrine-G in AIS-assemblage vertraagd. Daarom is het van cruciaal belang om AIS-assemblage te bestuderen in ankyrine-G-null neuronen die geen vooraf geassembleerde AIS hebben.
Hier presenteren we een methode om de assemblage en structuur van de AIS te bestuderen met behulp van gekweekte hippocampale neuronen van ANK3-E22/23-flox muizen die alle isovormen van ankyrine-G13 elimineert (Figuur 1B). Door neuronen te transfecteren met een Cre-BFP-constructie voordat AIS wordt geassembleerd, genereerden we ankyrine-G-deficiënte neuronen die volledig geen AIS hadden (Figuur 1B, Figuur 2). De assemblage van AIS wordt volledig gered na co-transfectie van 480 kDa ankyrine-G-GFP plasmide met een Cre-BFP plasmide. Deze methode biedt een manier om de AIS-assemblage te bestuderen in een niet-voorgemonteerde AIS-omgeving. We hebben ook het glia-neuron co-cultuursysteem van Gary Banker aangepast zonder antibiotica te gebruiken, eerder ontworpen voor embryonale dag 18 neuronen, voor toepassing op postnatale muisneuronen en een AIS-kwantificeringsmethode aangepast aan gemiddelde AIS-metingen van meerdere neuronen om de variatie van AIS14,15te normaliseren .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18mm coverglass (1.5D)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-84-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#31059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Tripsin without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>480kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>lab made</td>
			<td>Provide upon request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANK3-E22/23f/f mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>Stock No: 029797</td>
			<td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer with 70-mm mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic coverslip-staining rack</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-BFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#128174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM with Earle&#8217;s salts and L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 70%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>225711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26124-78-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments

Neuronale axon initiële segmenten (AIS) zijn plaatsen van initiatie van actiepotentiaal en zijn uitgebreid bestudeerd op hun moleculaire structuur, assemblage en activiteitsafhankelijke plasticiteit. Giant ankyrine-G, de hoofdorganisator van AIS, associeert direct met membraan-spanning gated sodium (VSVG) en kaliumkanalen (KCNQ2/3), evenals 186 kDa neurofascine, een L1CAM celadhesiemolecuul. Giant ankyrine-G bindt ook aan en rekruteert cytoplasmatische AIS moleculen waaronder bèta-4-spectrine, en de microtubulusbindende eiwitten, EB1/EB3 en Ndel1. Reuze ankyrine-G is voldoende om AIS-vorming in ankyrine-G-deficiënte neuronen te redden. Ankyrine-G omvat ook een kleinere 190 kDa isoform gelegen op dendritische stekels in plaats van de AIS, die niet in staat is om zich te richten op de AIS of het redden van de AIS in ankyrine-G-deficiënte neuronen. Hier beschreven we een protocol met gekweekte hippocampale neuronen van ANK3-E22/23-floxmuizen, die, wanneer getransfecteerd met Cre-BFP, verlies van alle isovorm van ankyrine-G vertonen en de vorming van AIS belemmeren. Gecombineerd met een gemodificeerd Banker glia/neuron co-cultuursysteem, ontwikkelden we een methode om ankyrine-G null neuronen te transfecteren met een 480 kDa ankyrine-G-GFP plasmide, wat voldoende is om de vorming van AIS te redden. We gebruiken verder een kwantificeringsmethode, ontwikkeld door Salzer en collega's om te gaan met variatie in AIS-afstand tot de neuronale cellichamen die optreedt in hippocampale neuronculturen. Dit protocol maakt kwantitatieve studies van de de novo assemblage en dynamisch gedrag van AIS mogelijk.

Een volledige reeks experimenten moet cre-BFP alleen transfectie als negatieve controle, Cre-BFP plus 480 kDa ankyrine-G co-transfectie als positieve controle en een niet-getransfecteerde toestand als techniekcontrole omvatten. In cre-BFP alleen controle, transfected neuronen missen de accumulatie van AIS markers, met inbegrip van ankyrine-G (ankG), beta4-spectrine (β4), neurofascin (Nf) en voltage gated sodium channels (VSVG) (Figuur 4A)16. Cre en 480 kDa ankyrine-G...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Hier beschreven we een protocol om de assemblage en structuur van de axon initiële segmenten (AIS) van hippocampale neuronen die geen vooraf geassembleerde AIS missen vanwege de afwezigheid van een gigantische ankyrine-G kwantitatief te bestuderen.

Gebruik van primaire gekweekte hippocampale neuronen om de assemblage van axon-initiële segmenten te bestuderen

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Dit protocol wordt gebruikt om kwantitatief de assemblage en structuur van de axon initiële segmenten van Hippocampal Neuronen die niet vooraf geassembleerd AIS als gevolg van de afwezigheid van een gigantische ankyrine-G bestuderen. Ontleed om te beginnen zes tot acht hippocampi van postnatale, eendagsjongen met HBSS-medium in een Petrischaal. Hak de hippocampi met dissectieschaar in kleinere stukken en breng ze over van de schaal naar een buis van 15 milliliter.Was de hippocampi tweemaal met vijf milliliter HBSS en laat ze na het wassen in 4,5 milliliter HBSS. Voeg 0,5 milliliter 2,5% trypsine toe aan 4,5 milliliter HBSS en incubeer gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius, waarbij de buis elke vijf minuten wordt omgekeerd. Goed verteerde hippocampi moeten plakkerig worden en een cluster vormen.Verleng indien nodig de spijsvertering nog vijf minuten. Was hippocampi drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt met HBSS. Voeg na het wassen twee milliliter HBSS toe en pipet de hippocampi 15 keer op en neer met een Pasteur pipet.Tritureer het weefsel 10 keer met een vuur gepolijste Pasteur pipet en laat de buis vijf minuten rusten totdat alle brokken op de bodem zijn gezet. Herhaal de trituratie met de resterende brokken totdat de meeste zijn verdwenen. Gebruik vervolgens een pipetpunt van één milliliter om het supernatant met de gedissocieerde neuronen voorzichtig over te brengen naar plating-gerechten.Voeg het direct toe aan het voorgeïncubeerde beplatingsmedium en schud de plaat zachtjes. Controleer twee tot vier uur na het zaaien de beplatingsschalen met een lichte microscoop. De meerderheid van de neuronen moet zich aan de afdekstrip hebben bevestigd.Draai met behulp van een fijne tip forceps de hoesjes naar de gliacelinvoerschalen met geconditioneerd neuronaal cultuurmedium met de waspuntenzijde naar beneden gericht. Neuronen kunnen tot een maand in de gliacelvoederschalen groeien. Voer neuronen elke zeven dagen met één milliliter vers neuronaal cultuurmedium.Op de derde dag in vitro, draai de hoes slips met de wax dot kant naar boven in een gliacel feeder schotel met geconditioneerde neuronale cultuur medium. Meng 0,25 microgram CRE BFP DNA met 0,5 microgram ankyrine-GFP DNA in een buis van 1,7 milliliter om vier afdekstroken te transfecteren. Voeg 100 microliters optimaal toe.Meng vervolgens de buis en rust op een rek. Als alleen CRE BFP wordt getransfecteerd, wordt de GFP plasmische ruggengraat gebruikt om de totale hoeveelheid DNA te matchen. Meng drie microliters transfectiereagens met 100 microliter optimum in een nieuwe buis van 1,7 milliliter en incubeer de buis gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Meng vervolgens 100 microliter van het eerder gemengde DNA met 100 microliters transfectiereagensmix en laat het vijf tot tien minuten op een rek staan. Voeg 50 microliters van de DNA-mix toe bovenop elke afdekstrook door de punt net onder het medium in te brengen zonder de afdekslips aan te raken. Pipet langzaam om verspreiding van de DNA-mix te voorkomen.Breng het gerecht langzaam terug naar de incubator en laat het daar 30 tot 45 minuten staan. Draai de hoes terug naar de glia-feederschaal thuis met de waspuntzijde naar beneden gericht en plaats de schaal terug in de incubator. Voor AIS-kwantificering opent u de afbeeldingen uit de Z-serie in Fiji en genereert u een maximale projectie van afbeeldingen.Nadat u het lege achtergrondsignaal van de omslagstrook van de afbeelding hebt afgetrokken, tekent u een lijn langs de AIS en zorgt u ervoor dat de breedte van de lijn het AIS volledig bedekt. Start de lijn voordat het AIS-signaal boven de achtergrond wordt verhoogd en stop nadat het naar de achtergrond is gedropt. Meet de gemiddelde pixelintensiteit langs de lijn en exporteer deze naar een spreadsheet.Voer vervolgens een MATLAB-script uit om het uiteindelijke cijfer te genereren. Het experiment moet cre-BFP alleen transfectie als negatieve controle, Cre-BFP plus 480 kilodalton ankyrine-G cotransfectie als positieve controle en een niet-getransfecteerde toestand als techniekcontrole omvatten. In de Cre-BFP-controle missen getransfecteerde neuronen de accumulatie van AIS-markers, waaronder ankyrine-G, bèta 4-spectrine, neurofascine en spanningsge gated natriumkanalen.Cre en 480 kilodalton ankyrine-G co-transfected neuronen hebben daarentegen AIS volledig geassembleerd, wat wordt aangetoond door de aanwezigheid van AIS-markers. Het is belangrijk om de kwaliteit van de cultuur te bevestigen door vergelijking met de niet-getransfecteerde gerechten. Ongezonde neuronen hebben de neiging om abnormale AIS-structuur te vertonen, zoals gestaakte of ectopische AIS.Om te evalueren hoe een ankyrine-G menselijke neuroontwikkelingsstoornismutatie de AIS-assemblage beïnvloedt, werd de gemiddelde AIS-intensiteit uitgezet van de soma tot het distale axon. AIS verrijkte eiwitten vertonen normaal gesproken een snelle toename van het signaal van het proximale axon en een langzame afname van het signaal naar het distale axon. Wanneer uitgelijnd met de niet-getransfecteerde AIS, is de mutante curve breder en de piek van de curve lager, wat wijst op een structuurverandering van AIS.Het wilde type ankyrine-G verzamelde AIS nauw afgestemd op de niet-getransfecteerde.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in Dendritische stekels van Cultured hippocampus Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Gebruik van pHluorine om de dynamiek van Axon Guidance Receptoren in celcultuur en in het kuikenembryo te beoordelen

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...