Name: use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00
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Wir danken Dr. Gary Banker für den Vorschlag zum neuronalen Kulturprotokoll. Diese Arbeit wird vom Howard Hughes Medical Institute, einem Stipendium des NIH und einer George Barth Geller-Professur (V.B.) unterstützt.

HINWEIS: Diese Kulturmethode von Hippocampus-Neuronen aus postnatalen 0-Tage-ANK3-E22/23f/f-Mäusen wurde von Gary Bankers Glia/Neuron-Co-Culture-System adaptiert. Daher ist es wichtig, alle Schritte nach der Dissektion in einer sauberen Haube mit sterilisierten Werkzeugen durchzuführen. Dieses Protokoll dauert bis zu 1 Monat. Der Workflow wird in Abbildung 3angezeigt. Das Protokoll folgt den Tierrichtlinien der Duke University.
1. Zubereitung ...

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	<li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP.">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li><li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors.">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li><li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM.">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li><li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex.">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).</li><li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development.">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li><li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+activity+regulates+Na(+)+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment.">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability.">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li><li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon.">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li><li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Made+for+"anchorin":+Kv7.2/7.3+(KCNQ2/KCNQ3)+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons.">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing.">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li><li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier.">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G:+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling.">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin.">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment.">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly.">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li></ol>

Die Montage von AIS wird von 480 kDa Ankyrin-G organisiert. Ankyrin-G hat jedoch kürzere Isoformen, die auf den AIS von Wildtyp-Neuronen abzielen können, was zu Schwierigkeiten bei der Interpretation von Struktur-Funktions-Analysen der AIS-Assemblierung führen kann. Hier stellen wir eine Methode mit Neuronen von ANK3-E22/23-flox-Mäusen vor, die es ermöglicht, die De-novo-Assemblierung des AIS zu untersuchen. Durch transfizierend mit Cre-BFP bei 3 div eliminieren wir alle endogenen Isoformen von An...

Das Axon-Anfangssegment befindet sich am proximalen Axon in den meisten Wirbeltierneuronen. Funktional ist AIS der Ort, an dem Aktionspotentiale aufgrund der hohen Dichte spannungsgesteuerter Natriumkanäle in diesem Bereich initiiert werden. AIS einiger exzitatorischer Neuronen werden auch von inhibitorischen Interneuronen durch die Bildung von GABAergen Synapsen1,2,3angegriffen. Daher ist AIS ein kritischer Ort, um Zellsignale zu integrieren und die Erregbarkeit von Neuronen zu modulieren. AIS ist normalerweise 20-60 μm lang und befindet sich innerhalb von 20 μm des Zellkörpers. Die Länge und Position von AIS variiert in Neuronen über Gehirnregionen hinweg sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien desselben Neurons4,5. Gesammelte Beweise deuten darauf hin, dass die Zusammensetzung und Position von AIS dynamisch auf die Veränderung der neuronalen Aktivitätreagieren 4,5,6,7.
480 kDa Ankyrin-G ist der Master-Organizer von AIS. 480 kDa Ankyrin-G ist ein membranassoziiertes Adapterprotein, das direkt an spannungsgesteuerte Natriumkanäle sowie andere wichtige AIS-Proteine bindet, einschließlich Beta4-Spectrin, KCNQ2/3-Kanäle, die die Natriumkanalaktivität8,9und 186 kDa-Neurofascin modulieren, ein L1CAM, das GABAerge Synapsen zum AIS2,10leitet. 480 kDa Ankyrin-G teilt kanonische Ankyrindomänen, die in der kurzen 190 kDa Ankyrin-G-Isoform (ANK-Wiederholungen, Spectrin-Bindungsdomäne, regulatorische Domäne) gefunden werden, unterscheiden sich jedoch durch ein riesiges Exon, das nur in Wirbeltieren vorkommt und spezifisch in Neuronen exprimiert wird (Abbildung 1A)11,12. Die 480 kDa Ankyrin-G Neuronen-spezifische Domäne (NSD) wird für die AIS-Bildungbenötigt 12. Das 190 kDa Ankyrin-G fördert nicht die AIS-Assemblierung oder zielt AIS in Ankyrin-G-Null-Neuronen12. Allerdings sind 190 kDa Ankyrin-G am AIS konzentriert und enthalten 480 kDa Ankyrin-G12. Diese Fähigkeit des 190 kDa Ankyrin-G, auf vormontierte AIS von Wildtyp-Neuronen zu zielen, war eine Quelle der Verwirrung in der Literatur und hat die Wertschätzung der kritischen Spezialfunktionen des 480 kDa Ankyrin-G in der AIS-Assemblierung verlangsamt. Daher ist es wichtig, die AIS-Assemblierung in Ankyrin-G-Null-Neuronen zu untersuchen, denen ein vormontiertes AIS fehlt.
Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung des Aufbaus und der Struktur des AIS mit kultivierten Hippocampus-Neuronen von ANK3-E22/23-flox-Mäusen vor, die alle Isoformen von Ankyrin-G13 eliminiert (Abbildung 1B). Durch die Transfektierung von Neuronen mit einem Cre-BFP-Konstrukt, bevor AIS zusammengesetzt wird, erzeugten wir Ankyrin-G-defiziente Neuronen, die völlig ohne AIS waren (Abbildung 1B, Abbildung 2). Die Montage von AIS ist nach Co-Transfektion von 480 kDa Ankyrin-G-GFP-Plasmid mit einem Cre-BFP-Plasmid vollständig gerettet. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die AIS-Assembly in einer nicht vormontierten AIS-Umgebung zu untersuchen. Wir modifizierten auch das Glia-Neuron-Co-Culture-System von Gary Banker ohne Verwendung von Antibiotika, das zuvor für embryonale Neuronen am Tag 18 entwickelt wurde, für die Anwendung auf postnatale Mausneuronen und passten eine AIS-Quantifizierungsmethode an durchschnittliche AIS-Messungen von mehreren Neuronen an, um die Variation von AIS14,15zu normalisieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18mm coverglass (1.5D)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-84-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#31059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Tripsin without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>480kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>lab made</td>
			<td>Provide upon request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANK3-E22/23f/f mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>Stock No: 029797</td>
			<td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer with 70-mm mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic coverslip-staining rack</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-BFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#128174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM with Earle&#8217;s salts and L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 70%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>225711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26124-78-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments

Neuronale Axon-Initialsegmente (AIS) sind Orte der Initiierung von Aktionspotentialen und wurden umfassend auf ihre molekulare Struktur, Anordnung und aktivitätsabhängige Plastizität untersucht. Giant Ankyrin-G, der Hauptorganisator von AIS, verbindet sich direkt mit membranübergreifenden spannungsgesteuerten Natrium- (VSVG) und Kaliumkanälen (KCNQ2/3) sowie 186 kDa-Neurofaszin, einem L1CAM-Zelladhäsionsmolekül. Riesen-Ankyrin-G bindet und rekrutiert auch zytoplasmatische AIS-Moleküle, einschließlich Beta-4-Spectrin und die Mikrotubuli-bindenden Proteine EB1 / EB3 und Ndel1. Riesiges Ankyrin-G reicht aus, um die AIS-Bildung in Ankyrin-G-defizienten Neuronen zu retten. Ankyrin-G enthält auch eine kleinere 190 kDa-Isoform, die sich an dendritischen Stacheln anstelle des AIS befindet, die nicht in der Lage ist, auf den AIS zu zielen oder den AIS in Ankyrin-G-defizienten Neuronen zu retten. Hier beschrieben wir ein Protokoll mit kultivierten Hippocampus-Neuronen von ANK3-E22/23-Flox-Mäusen, die, wenn sie mit Cre-BFP transfiziert werden, einen Verlust aller Isoformen von Ankyrin-G aufweisen und die Bildung von AIS beeinträchtigen. In Kombination eines modifizierten Banker-Glia/Neuron-Co-Culture-Systems entwickelten wir eine Methode, um Ankyrin-G-Nullneuronen mit einem 480 kDa Ankyrin-G-GFP-Plasmid zu transfizieren, das ausreicht, um die Bildung von AIS zu retten. Darüber hinaus verwenden wir eine quantifizierungsmethode, die von Salzer und Kollegen entwickelt wurde, um die Variation der AIS-Entfernung von den neuronalen Zellkörpern zu behandeln, die in Hippocampus-Neuronenkulturen auftritt. Dieses Protokoll ermöglicht quantitative Untersuchungen der De-novo-Assemblierung und des dynamischen Verhaltens von AIS.

Ein vollständiger Satz von Experimenten sollte Cre-BFP nur Transfektion als Negativkontrolle, Cre-BFP plus 480 kDa Ankyrin-G Co-Transfektion als Positivkontrolle und eine nicht transfizierte Bedingung als Technikkontrolle enthalten. Bei der reinen Cre-BFP-Kontrolle fehlt transfizierten Neuronen die Akkumulation von AIS-Markern, einschließlich Ankyrin-G (ankG), Beta4-Spectrin (β4), Neurofascin (Nf) und spannungsgesteuerten Natriumkanälen (VSVG)(Abbildung 4A)16. Im ...

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Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Hier beschrieben wir ein Protokoll zur quantitativen Untersuchung der Anordnung und Struktur der Axon-Anfangssegmente (AIS) von Hippocampus-Neuronen, denen aufgrund des Fehlens eines riesigen Ankyrin-G ein vormontiertes AIS fehlt.

Verwendung von primär kultivierten Hippocampus-Neuronen zur Untersuchung der Anordnung von Axon-Anfangssegmenten

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Dieses Protokoll wird verwendet, um die Anordnung und Struktur der Axon-Anfangssegmente von Hippocampus-Neuronen, denen aufgrund des Fehlens eines riesigen Ankyrin-G ein vormontiertes AIS fehlt, quantitativ zu untersuchen. Sezieren Sie zunächst sechs bis acht Hippocampi von postnatalen, eintägigen Welpen mit HBSS-Medium in einer Petrischale. Die Hippocampi mit einer Sezierschere in kleinere Stücke schneiden und von der Schale in ein 15-Milliliter-Röhrchen geben.Waschen Sie die Hippocampi zweimal mit fünf Millilitern HBSS und lassen Sie sie nach dem Waschen in 4,5 Millilitern HBSS. Fügen Sie 0,5 Milliliter 2,5% Trypsin in 4,5 Milliliter HBSS hinzu und inkubieren Sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 15 Minuten, wobei Sie das Röhrchen alle fünf Minuten umkehren. Gut verdaute Hippocampi sollten klebrig werden und eine Gruppe bilden.Bei Bedarf die Verdauung um weitere fünf Minuten verlängern. Hippocampi dreimal mit HBSS für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Nach dem Waschen zwei Milliliter HBSS hinzufügen und die Hippocampi 15 Mal mit einer Pasteur-Pipette auf und ab pipetten.Triturieren Sie das Gewebe mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette 10 Mal und legen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang ab, bis alle Brocken auf den Boden gesetzt sind. Wiederholen Sie die Trituration mit den verbleibenden Brocken, bis die meisten von ihnen verschwunden sind. Verwenden Sie dann eine Pipettenspitze von einem Milliliter, um den Überstand, der die dissoziierten Neuronen enthält, vorsichtig auf das Beschichtungsgeschirr zu übertragen.Direkt in das vorinkubierte Beschichtungsmedium geben und die Platte vorsichtig schütteln. Überprüfen Sie zwei bis vier Stunden nach der Aussaat die Beschichtungsschalen mit einem Lichtmikroskop. Der Großteil der Neuronen sollte am Deckzettel befestigt sein.Drehen Sie mit einer feinen Spitzenzette die Abdeckung zu den Gliazellen-Feederschalen, die vorkonditioniertes neuronales Kulturmedium enthalten, wobei die Wachspunkte nach unten zeigen. Neuronen können in den Gliazellen-Futterschalen bis zu einem Monat lang wachsen. Füttern Sie Neuronen alle sieben Tage mit einem Milliliter frischem neuronalem Kulturmedium.Am dritten Tag in vitro schlüpft der Deckel mit der Wachspunktseite nach oben in eine Gliazellen-Futterschale mit konditioniertem neuronalem Kulturmedium. Mischen Sie 0,25 Mikrogramm CRE BFP DNA mit 0,5 Mikrogramm Ankyrin-G GFP DNA in einem 1,7 Milliliter Röhrchen, um vier Cover-Slips zu transfizieren. Fügen Sie 100 Mikroliter optimal hinzu.Dann mischen Sie die Tube und ruhen auf einem Rack. Wenn nur CRE BFP transfiziert wird, wird das GFP-Plasmische Rückgrat verwendet, um die Gesamtmenge an DNA abzugleichen. Mischen Sie drei Mikroliter Transfektionsreagenz mit 100 Mikrolitern Optimum in einem neuen 1,7-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Mischen Sie dann 100 Mikroliter der zuvor gemischten DNA mit 100 Mikrolitern Transfektionsreagenzmischung und lassen Sie sie fünf bis 10 Minuten auf einem Rack stehen. Fügen Sie 50 Mikroliter des DNA-Mixes auf jeden Deckzettel hinzu, indem Sie die Spitze direkt unter das Medium einführen, ohne die Deckzettel zu berühren. Pipette langsam, um eine Ausbreitung des DNA-Mixes zu vermeiden.Bringen Sie die Schüssel langsam zurück in den Inkubator und lassen Sie sie dort für 30 bis 45 Minuten stehen. Drehen Sie die Abdeckung zurück zur Gliaschale zu Hause mit der Wachspunktseite nach unten und stellen Sie die Schüssel wieder in den Inkubator. Für die AIS-Quantifizierung öffnen Sie die Bilder der Z-Serie in Fidschi und generieren Sie eine maximale Projektion von Bildern.Nachdem Sie das Hintergrundsignal für den leeren Cover-Slip vom Bild subtrahiert haben, zeichnen Sie eine Linie entlang des AIS und stellen Sie sicher, dass die Breite der Linie den AIS vollständig abdeckt. Starten Sie die Linie, bevor das AIS-Signal über den Hintergrund ausgelöst wird, und stoppen Sie, nachdem es in den Hintergrund fällt. Messen Sie die mittlere Pixelintensität entlang der Linie und exportieren Sie sie in eine Tabelle.Führen Sie dann ein MATLAB-Skript aus, um die endgültige Zahl zu generieren. Das Experiment sollte Cre-BFP nur Transfektion als Negativkontrolle, Cre-BFP plus 480 Kilodalton Ankyrin-G Kotransfektion als Positivkontrolle und einen nicht transfizierten Zustand als Technikkontrolle umfassen. In der reinen Cre-BFP-Kontrolle fehlt transfizierten Neuronen die Ansammlung von AIS-Markern, einschließlich Ankyrin-G, Beta-4-Spectrin, Neurofaszin und spannungsgesteuerten Natriumkanälen.Im Gegensatz dazu haben Cre und 480 Kilodalton Ankyrin-G co-transfizierte Neuronen vollständig zusammengesetzte AIS, was durch das Vorhandensein von AIS-Markern gezeigt wird. Es ist wichtig, die Qualität der Kultur durch Vergleich mit den nicht transfizierten Gerichten zu bestätigen. Ungesunde Neuronen neigen dazu, eine abnormale AIS-Struktur zu zeigen, wie abgesetzte oder ektopische AIS.Um zu beurteilen, wie sich eine Mutation einer ankyrin-G-neurologischen Entwicklungsstörung auf die AIS-Assemblierung auswirkt, wurde die durchschnittliche AIS-Intensität vom Soma bis zum distalen Axon dargestellt. AIS-angereicherte Proteine zeigen normalerweise einen schnellen Anstieg des Signals vom proximalen Axon und eine langsame Abnahme des Signals zum distalen Axon. Wenn sie mit dem nicht transfizierten AIS ausgerichtet ist, ist die Mutantenkurve breiter und der Peak der Kurve niedriger, was auf eine Strukturänderung von AIS hindeutet.Das Wildtyp-Ankyrin-G-AIS, das eng mit dem nicht transfizierten AIS übereinstimmt.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Verwendung von pHluorin zur Bewertung der Dynamik von Axon-Leitrezeptoren in der Zellkultur und im Küken-Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...