Name: use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

हम न्यूरोनल कल्चर प्रोटोकॉल पर सुझाव के लिए डॉ गैरी बैंकर को धन्यवाद देते हैं । यह काम हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट, एनआईएच से अनुदान, और जॉर्ज बार्थ गेलर संपन्न प्रोफेसरशिप (V.B.) द्वारा समर्थित है।

नोट: प्रसवोत्तर 0 दिन ANK3-E22/23f/f चूहों से हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की यह संस्कृति विधि गैरी बैंकर की ग्लिया/न्यूरॉन सह-संस्कृति प्रणाली से अनुकूलित है । इसलिए, निष्फल उपकरणों का उपयोग करके एक साफ हुड ?...

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	<li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP.">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li><li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors.">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li><li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM.">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li><li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex.">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).</li><li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development.">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li><li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+activity+regulates+Na(+)+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment.">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability.">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li><li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon.">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li><li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Made+for+"anchorin":+Kv7.2/7.3+(KCNQ2/KCNQ3)+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons.">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing.">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li><li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier.">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G:+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling.">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin.">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment.">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly.">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li></ol>

एआईएस की असेंबली का आयोजन 480 केडीए ेंकिरिन-जी द्वारा किया जाता है। हालांकि, एंकिरिन-जी में छोटे आइसोफॉर्म हैं जो वाइल्डटाइप न्यूरॉन्स के एआईएस को लक्षित कर सकते हैं, जिससे एआईएस असेंबली के संरचना-कार्य...

अक्षतंश प्रारंभिक खंड सबसे कशेरुकी न्यूरॉन्स में समीपस्थ अक्षांश पर स्थित है। कार्यात्मक रूप से, एआईएस वह जगह है जहां इस क्षेत्र में वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनलों के उच्च घनत्व के कारण कार्रवाई क्षमता शुरू की जाती है। कुछ उत्तेजक न्यूरॉन्स के एआईएस को भी गैबर्जिक सिनेप्स 1 , 2,3बनाने के माध्यम से निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन्स द्वारा लक्षित कियाजाताहै । इसलिए, एआईएस सेल सिग्नलिंग को एकीकृत करने और न्यूरॉन्स की उत्तेजना को संशोधित करने के लिए एक महत्वपूर्ण साइट है। एआईएस आम तौर पर लंबाई में 20-60 माइक्रोन है और कोशिका शरीर के 20 माइक्रोन के भीतर स्थित है। एआईएस की लंबाई और स्थिति मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स में भिन्न होती है, साथ ही एक ही न्यूरॉन4,5के विभिन्न विकासात्मक चरणों में भी भिन्न होती है। संचित साक्ष्यों से यह पता चला कि न्यूरोनल गतिविधि 4,5,6,7के परिवर्तन का जवाब देने में एआईएस की संरचना और स्थिति गतिशील है ।
480 केडीए ेंकिरिन-जी एआईएस के मास्टर ऑर्गनाइजर हैं। 480 केडीए एंकिरिन-जी एक झिल्ली से जुड़े एडाप्टर प्रोटीन है जो सीधे वोल्टेज गेटेड सोडियम चैनलों के साथ-साथ बीटा 4-स्पेक्ट्रिन, केसीएनक्यू 2/3 चैनलों सहित अन्य प्रमुख एआईएस प्रोटीन को बांधता है जो सोडियम चैनल गतिविधि8,9और186 केडीए न्यूरोफासिन को मिलाते हैं, एक एल1कैम जो गैबेर्गिक सिंपस को ए2,100को निर्देशित करता है। 480 केडीए एंकिरिन-जी शेयर कम 190 केडीए एंकिरिन-जी आइसोफॉर्म (एएनके रिपीट्स, स्पेक्ट्रिन बाइंडिंग डोमेन, रेग्युलेटरी डोमेन) में पाए जाने वाले कैनोलॉजिकल एंकिरिन डोमेन, लेकिन एक विशालकाय एक्सोन द्वारा प्रतिष्ठित किए जाते हैं जो केवल कशेरुकी में पाया जाता है और विशेष रूप से न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है(चित्रा 1A)11,12। एआईएस गठन12के लिए 480 केडीए एंकिरिन-जी न्यूरॉन विशिष्ट डोमेन (एनएसडी) की आवश्यकता है। 1 9 0 केडीए एंकिरिन-जी एआईएस असेंबली को बढ़ावा नहीं देता है या एंकिरिन-जी-नल न्यूरॉन्स12में एआईएस को लक्षित नहीं करता है। हालांकि, 190 केडीए एंकिरिन-जी एआईएस पर केंद्रित है जिसमें 480 केडीए एंकिरिन-जी12है। वाइल्डटाइप न्यूरॉन्स के पूर्व-इकट्ठे एआईएस को लक्षित करने के लिए 1 9 0 केडीए एंकिरिन-जी की यह क्षमता साहित्य में भ्रम का स्रोत रही है और एआईएस असेंबली में 480 केडीए एंकिरिन-जी के महत्वपूर्ण विशेष कार्यों की सराहना धीमी हो गई है। इसलिए, एंकिरिन-जी-नल न्यूरॉन्स में एआईएस असेंबली का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है जिसमें पूर्व-इकट्ठे एआईएस की कमी है।
यहां, हम ANK3-E22/23-flox चूहों से सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग करके एआईएस की असेंबली और संरचना का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो एंकिरिन-जी 13(चित्रा 1B)के सभी आइसोफॉर्म को समाप्त करता है। एआईएस के इकट्ठा होने से पहले क्रे-बीएफपी निर्माण के साथ न्यूरॉन्स को ट्रांसफेक्ट करके, हमने एंकिरिन-जी-कमी वाले न्यूरॉन्स को पूरी तरह से एआईएस(चित्रा 1 बी, चित्रा 2)की कमी पैदा की। एआईएस की असेंबली को क्रे-बीएफपी प्लाज्मिड के साथ 480 केडीए एंकिरिन-जी-जीएफपी प्लाज्मिड के सह-ट्रांसफैक्शन के बाद पूरी तरह से बचाया गया है। यह विधि एक गैर-पूर्व-इकट्ठे एआईएस वातावरण में एआईएस असेंबली का अध्ययन करने का एक तरीका प्रदान करती है। हमने एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग किए बिना गैरी बैंकर से ग्लिया-न्यूरॉन सह-संस्कृति प्रणाली को भी संशोधित किया, जो पहले भ्रूणीय दिन 18 न्यूरॉन्स के लिए डिज़ाइन किया गया था, पोस्टनेटल माउस न्यूरॉन्स के लिए आवेदन के लिए और एआईएस14, 15की भिन्नता को सामान्य बनाने के लिए कई न्यूरॉन्स से औसत एआईएस माप के लिए एआईएस क्वांटिटेशन विधि को अनुकूलित किया।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18mm coverglass (1.5D)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-84-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#31059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Tripsin without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>480kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>lab made</td>
			<td>Provide upon request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANK3-E22/23f/f mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>Stock No: 029797</td>
			<td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer with 70-mm mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic coverslip-staining rack</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-BFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#128174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM with Earle&#8217;s salts and L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 70%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>225711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26124-78-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments

न्यूरोनल एक्सॉन प्रारंभिक खंड (एआईएस) कार्रवाई क्षमता की शुरुआत की साइटें हैं और उनकी आणविक संरचना, असेंबली और गतिविधि पर निर्भर प्लास्टिसिटी के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। विशाल ankyrin-जी, AIS के मास्टर आयोजक, झिल्ली फैले वोल्टेज gated सोडियम (VSVG) और पोटेशियम चैनलों (KCNQ2/3), साथ ही साथ १८६ केडीए न्यूरोफैसिन, एक L1CAM सेल आसंजन अणु के साथ सीधे सहयोगियों । विशालकाय एंकिरिन-जी बीटा-4-स्पेक्ट्रिन, और माइक्रोट्यूबुले-बाइंडिंग प्रोटीन, ईबी 1/ईबी3 और Ndel1 सहित साइटोप्लाज्मिक एआईएस अणुओं को भी बांधता है और भर्ती करता है। विशालकाय एंकिरिन-जी एंकिरिन-जी की कमी न्यूरॉन्स में एआईएस गठन को बचाने के लिए पर्याप्त है। एंकिरिन-जी में एआईएस के बजाय डेंड्रिटिक कताई में स्थित एक छोटा 1 9 0 केडीए आइसोफॉर्म भी शामिल है, जो एआईएस को लक्षित करने या एआईएस को एंकिरिन-जी-कमी न्यूरॉन्स में एआईएस को बचाने में असमर्थ है। यहां, हमने ANK3-E22/23-flox चूहों से सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया, जो क्रे-बीएफपी से संक्रमित होने पर एंकिरिन-जी के सभी आइसोफॉर्म का नुकसान होता है और एआईएस के गठन को ख़राब करता है। एक संशोधित बैंकर ग्लिया/न्यूरॉन सह-संस्कृति प्रणाली को संयुक्त करते हुए, हमने 480 केडीए एंकिरिन-जी-जी-जीएफपी प्लाज्मिड के साथ एंकिरिन-जी नल न्यूरॉन्स को ट्रांसफेक्ट करने के लिए एक विधि विकसित की है, जो एआईएस के गठन को बचाने के लिए पर्याप्त है। हम हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन संस्कृतियों में होने वाले न्यूरोनल सेल निकायों से एआईएस दूरी में भिन्नता से निपटने के लिए साल्जर और सहयोगियों द्वारा विकसित एक मात्राकरण विधि को नियोजित करते हैं। यह प्रोटोकॉल डी नोवो असेंबली और एआईएस के गतिशील व्यवहार के मात्रात्मक अध्ययन की अनुमति देता है।

प्रयोग के एक पूर्ण सेट में क्रे-बीएफपी केवल नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ट्रांसफैक्शन, क्रे-बीएफपी प्लस 480 केडीए एंकिरिन-जी सह-ट्रांसफैक्शन को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में और तकनीक नियंत्रण के रूप म?...

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Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

यहां, हमने हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के एक्सॉन प्रारंभिक खंडों (एआईएस) की असेंबली और संरचना का मात्रात्मक रूप से अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जिसमें एक विशाल एंकिरिन-जी की अनुपस्थिति के कारण पूर्व-इकट्ठे एआईएस की कमी है।

एक्सोन प्रारंभिक खंडों की असेंबली का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक संस्कारित हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

इस प्रोटोकॉल का उपयोग हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के एक्सॉन प्रारंभिक खंडों की असेंबली और संरचना का मात्रात्मक रूप से अध्ययन करने के लिए किया जाता है, जिसमें एक विशाल एंकिरिन-जी की अनुपस्थिति के कारण पूर्व-इकट्ठे एआईएस की कमी होती है। शुरू करने के लिए, प्रसवोत्तर से छह से आठ हिप्पोकैम्पी विच्छेदन, एक पेट्री डिश में HBSS माध्यम के साथ एक दिन पुराने पिल्ले । विच्छेदन कैंची के साथ हिप्पोकैम्पी को छोटे टुकड़ों में काट लें, और उन्हें पकवान से 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।एचबीएसएस के पांच मिलीलीटर के साथ दो बार हिप्पोकैम्पी धोएं, और धोने के बाद उन्हें एचबीएसएस के ४.५ मिलीलीटर में छोड़ दें । एचबीएसएस के 4.5 मिलीलीटर में 2.5% ट्राइपसिन के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेट करें, हर पांच मिनट में ट्यूब को उलटते हैं। अच्छी तरह से पचा हिप्पोकैम्पी चिपचिपा हो जाना चाहिए और एक क्लस्टर के रूप में।जरूरत पड़ने पर पाचन को पांच मिनट और बढ़ाएं। प्रति धोने पांच मिनट के लिए तीन बार HBSS के साथ हिप्पोकैम्पी धोएं । धोने के बाद, एचबीबीएस के दो मिलीलीटर जोड़ें और हिप्पोकैम्पी को 15 बार पाश्चुर पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पिपेट करें।एक आग पॉलिश पाश्चर पिपेट के साथ ऊतक को 10 बार ट्रिट करें, और ट्यूब को पांच मिनट तक आराम करें जब तक कि सभी हिस्सा नीचे तक सेट न हो जाए। शेष हिस्सा के साथ ट्रिट्यूशन दोहराएं जब तक कि उनमें से अधिकांश गायब न हो जाएं। फिर, एक मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग धीरे-धीरे अलग न्यूरॉन्स युक्त सुपरनैट को चढ़ाना व्यंजन में स्थानांतरित करने के लिए करें।इसे सीधे प्री इनक्यूबेटेड प्लेटिंग मीडियम में डालें और प्लेट को धीरे-धीरे हिलाएं। सीडिंग के दो से चार घंटे बाद, हल्के माइक्रोस्कोप से चढ़ाना व्यंजनों की जांच करें। न्यूरॉन्स के बहुमत कवर पर्ची से जुड़ा होना चाहिए था।एक ठीक टिप संदंश का उपयोग करना, कवर फ्लिप ग्लियल सेल फीडर व्यंजनों में फ्लिप करें जिसमें मोम डॉट्स साइड नीचे की ओर सामना करना पड़ रहा है। न्यूरॉन्स एक महीने तक के लिए ग्लियल सेल फीडर व्यंजन में विकसित कर सकते हैं। ताजा न्यूरोनल संस्कृति माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ हर सात दिनों में न्यूरॉन्स फ़ीड।विट्रो में तीसरे दिन, कवर स्लिप को मोम डॉट साइड के साथ फ्लिप करें जो वातानुकूलित न्यूरोनल कल्चर मीडियम के साथ ग्लियल सेल फीडर डिश में सामना कर रहा है। चार कवर स्लिप को ट्रांसफेक्ट करने के लिए १.७ मिलीलीटर ट्यूब में एंकिरिन-जीजीएफपी डीएनए के ०.५ माइक्रोग्राम के साथ सीआरई बीएफपी डीएनए के ०.२५ माइक्रोग्राम मिलाएं । इसमें 100 माइक्रोलीटर इष्टतम डालें।फिर ट्यूब मिलाकर एक रैक पर विश्राम किया। यदि केवल सीआरई बीएफपी संक्रमित है, तो जीएफपी प्लाज्मिक बैकबोन का उपयोग डीएनए की कुल राशि से मेल खाने के लिए किया जाता है। एक नई १.७ मिलीलीटर ट्यूब में इष्टतम के १०० माइक्रोलीटर के साथ ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के तीन माइक्रोलीटर मिलाएं और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें ।फिर, ट्रांसफेक्शन रीएजेंट मिक्स के 100 माइक्रोलीटर के साथ पहले मिश्रित डीएनए के 100 माइक्रोलीटर मिलाएं, और इसे एक रैक पर पांच से 10 मिनट के लिए छोड़ दें। कवर स्लिप को छुए बिना माध्यम के ठीक नीचे टिप डालकर प्रत्येक कवर स्लिप के ऊपर डीएनए मिक्स के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। डीएनए मिश्रण फैलाने से बचने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करें।धीरे-धीरे डिश को इनक्यूबेटर में वापस लाएं और उसे वहां 30 से 45 मिनट के लिए छोड़ दें। फ्लिप कवर नीचे का सामना करना पड़ मोम डॉट साइड के साथ घर ग्लियल फीडर डिश के लिए वापस फिसल जाता है और पकवान वापस इनक्यूबेटर में डाल दिया । एआईएस क्वांटिफिकेशन के लिए, फिजी में जेड श्रृंखला छवियों को खोलें और छवियों का अधिकतम प्रक्षेपण उत्पन्न करें।छवि से खाली कवर स्लिप बैकग्राउंड सिग्नल को घटाने के बाद, एआईएस के साथ एक लाइन खींचें, जिससे यह सुनिश्चित किया जा सके कि लाइन की चौड़ाई पूरी तरह से एआईएस को कवर करती है। एआईएस सिग्नल को पृष्ठभूमि से ऊपर उठाए जाने से पहले लाइन शुरू करें और पृष्ठभूमि में गिरने के बाद बंद हो जाते हैं। लाइन के साथ मतलब पिक्सेल तीव्रता को मापने, और यह एक स्प्रेडशीट के लिए निर्यात ।फिर, अंतिम आंकड़ा उत्पन्न करने के लिए एक मैटलैब स्क्रिप्ट चलाएं। प्रयोग में क्रे-बीएफपी केवल नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ट्रांसफैक्शन, क्रे-बीएफपी प्लस 480 किलोडलटन एंकिरिन-जी कोट्रांसफेक्शन को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में और तकनीक नियंत्रण के रूप में एक गैर-संक्रमित स्थिति शामिल होनी चाहिए। क्रे-बीएफपी में केवल नियंत्रण, संक्रमित न्यूरॉन्स में एआईएस मार्कर के संचय की कमी होती है, जिसमें एंकिरिन-जी, बीटा 4 स्पेक्ट्रिन, न्यूरोफासिन और वोल्टेज गेटेड सोडियम चैनल शामिल हैं।इसके विपरीत, क्रे और 480 किलोडल्टन एंकिरिन-जी सह-संक्रमित न्यूरॉन्स ने एआईआईएस को पूरी तरह से इकट्ठा किया है, जो एआईएस मार्कर की उपस्थिति द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। गैर-संक्रमित व्यंजनों के साथ तुलना के माध्यम से संस्कृति की गुणवत्ता की पुष्टि करना महत्वपूर्ण है। अस्वस्थ न्यूरॉन्स असामान्य एआईएस संरचना दिखाते हैं, जैसे बंद या एक्टोपिक एआईएस।मूल्यांकन करने के लिए कि कैसे एक ankyrin-जी मानव तंत्रिका विकास विकार उत्परिवर्तन AIS विधानसभा को प्रभावित करता है, औसत AIS तीव्रता सोमा से डिस्टल अक्षतंप के लिए साजिश रची गई थी । एआईएस समृद्ध प्रोटीन आम तौर पर समीपस्थ अक्षतंप से संकेत की तेजी से वृद्धि और डिस्टल एक्सॉन के लिए संकेत की धीमी कमी दिखाते हैं। जब गैर-संक्रमित एआईएस के साथ गठबंधन किया जाता है, तो उत्परिवर्ती वक्र व्यापक होता है और वक्र का शिखर कम होता है, जो एआईएस के संरचना परिवर्तन का सुझाव देता है।जंगली प्रकार ankyrin-जी इकट्ठे AIS बारीकी से गैर संक्रमित एक के साथ गठबंधन किया ।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection और भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति रिकवरी (FRAP) संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines में प्रतिदीप्ति प्रोटीन के टैग की गईं

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

संवर्धित वयस्क पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स साथ Axon पुनर्जनन की आनुवंशिक अध्ययन

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

इमेजिंग प्राथमिक संवर्धित माउस न्यूरॉन्स में प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर निवेशन pHluorin टैग

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

प्रोटीन Palmitoylation immunoprecipitation और एसाइल बायोटिन विनिमय (अबे) द्वारा संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स में जांच

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स की कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

सेल कल्चर और चिक भ्रूण में एक्सॉन गाइडेंस रिसेप्टर्स की गतिशीलता का आकलन करने के लिए pHluorin का उपयोग

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी का उपयोग चूहा प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines इमेजिंग

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...