Name: use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00
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Ringraziamo il Dr. Gary Banker per il suggerimento sul protocollo sulla cultura neuronale. Questo lavoro è sostenuto dall'Howard Hughes Medical Institute, una borsa di studio della NIH e una cattedra dotata di George Barth Geller (V.B.).

NOTA: Questo metodo di coltura dei neuroni ippocampali dai topi ANK3-E22/23f/f postnatali è adattato dal sistema di co-coltura glia/neurone di Gary Banker. Pertanto, è fondamentale eseguire tutti i passaggi dopo la dissezione in una cappa pulita utilizzando strumenti sterilizzati. Questo protocollo richiede fino a 1 mese. Il flusso di lavoro viene visualizzato nella figura 3. Il protocollo segue le linee guida sugli animali della Duke University.
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	<li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP.">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li><li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors.">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li><li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM.">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li><li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex.">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).</li><li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development.">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li><li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+activity+regulates+Na(+)+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment.">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability.">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li><li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon.">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li><li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Made+for+"anchorin":+Kv7.2/7.3+(KCNQ2/KCNQ3)+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons.">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing.">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li><li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier.">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G:+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling.">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin.">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment.">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly.">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li></ol>

L'assemblaggio dell'AIS è organizzato da 480 kDa ankyrin-G. Tuttavia, l'anchirina-G ha isoforme più corte che possono colpire l'AIS dei neuroni di tipo selvatico, il che può portare a difficoltà nell'interpretazione delle analisi struttura-funzione dell'assemblaggio AIS. Qui presentiamo un metodo che utilizza neuroni di topi ANK3-E22/23-flox che consente lo studio dell'assemblaggio de novo dell'AIS. Transfettando con Cre-BFP a 3 div, eliminiamo tutte le isoforme endogene di anchirina-G. Potremmo anc...

Il segmento iniziale dell'assone si trova all'assone prossimale nella maggior parte dei neuroni vertebrati. Funzionalmente, AIS è il luogo in cui vengono avviati potenziali d'azione a causa dell'alta densità dei canali del sodio gated di tensione in questa regione. L'AIS di alcuni neuroni eccitatori è anche preso di mira da internauri inibitori formando sinapsi GABAergiche1,2,3. Pertanto, AIS è un sito critico per integrare la segnalazione cellulare e modulare l'eccitabilità dei neuroni. AIS è normalmente lungo 20-60 μm e si trova entro 20 μm dal corpo cellulare. La lunghezza e la posizione dell'AIS varia nei neuroni tra le regioni cerebrali, così come in diversi stadi di sviluppo dello stessoneurone 4,5. Le prove accumulate hanno suggerito che la composizione e la posizione dell'AIS sono dinamiche nel rispondere al cambiamento dell'attivitàneuronale4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G è il master organizer di AIS. 480 kDa anchirina-G è una proteina adattatore associata alla membrana che si lega direttamente ai canali del sodio gated di tensione e ad altre principali proteine AIS tra cui beta4-spectrina, canali KCNQ2/3 che modulano l'attività del canale del sodio8,9e 186 kDa neurofascina, un L1CAM che dirige le sinapsi GABAergice all'AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G condivide domini di anchirina canonica trovati nel breve isoforma anchirina-G da 190 kDa (ANK ripete, dominio legante spectrin, dominio regolatore), ma si distinguono per un esone gigante che si trova solo nei vertebrati ed è specificamente espresso nei neuroni(Figura 1A)11,12. Il dominio specifico del neurone anchirina-G da 480 kDa (NSD) è necessario per la formazioneDIA 12. L'anchirina-G da 190 kDa non promuove l'assemblaggio AIS o l'AIS bersaglio nei neuroni anchirina-G-null12. Tuttavia, 190 kDa anchirina-G sono concentrati nell'AIS contenente 480 kDa anchirina-G12. Questa capacità dell'anchirina-G da 190 kDa di colpire l'AIS pre-assemblato dei neuroni di tipo selvatico è stata una fonte di confusione nella letteratura e ha rallentato l'apprezzamento delle funzioni critiche specializzate dell'anchirina-G da 480 kDa nell'assemblaggio AIS. Pertanto, è fondamentale studiare l'assemblaggio AIS in neuroni anchirina-G-null che mancano di un AIS pre-assemblato.
Qui presentiamo un metodo per studiare l'assemblaggio e la struttura dell'AIS utilizzando neuroni ippocampali coltivati da topi ANK3-E22/23-flox che elimina tutte le isoforme di anchirina-G13 (Figura 1B). Trasfettando i neuroni con un costrutto Cre-BFP prima che l'AIS sia assemblato, abbiamo generato neuroni carenti di anchirina-G completamente privi di AIS (Figura 1B, Figura 2). L'assemblaggio dell'AIS è completamente salvato a seguito della co-trasfezione di 480 kDa anchirina-G-GFP plasmide con un plasmide Cre-BFP. Questo metodo consente di studiare l'assembly AIS in un ambiente AIS non preassemblato. Abbiamo anche modificato il sistema di co-coltura glia-neurone da Gary Banker senza utilizzare antibiotici, precedentemente progettato per i neuroni del giorno embrionale 18, perl'applicazioneai neuroni del topo postnatale e adattato un metodo di quantificazione AIS alle misurazioni medie AIS da più neuroni per normalizzare la variazione di AIS 14,15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18mm coverglass (1.5D)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-84-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#31059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Tripsin without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>480kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>lab made</td>
			<td>Provide upon request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANK3-E22/23f/f mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>Stock No: 029797</td>
			<td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer with 70-mm mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic coverslip-staining rack</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-BFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#128174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM with Earle&#8217;s salts and L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 70%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>225711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26124-78-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments

I segmenti iniziali dell'assone neuronale (AIS) sono siti di iniziazione di potenziali d'azione e sono stati ampiamente studiati per la loro struttura molecolare, assemblaggio e plasticità dipendente dall'attività. L'anchirina gigante-G, il principale organizzatore dell'AIS, si associa direttamente ai canali del sodio gated al sodio (VSVG) e del potassio (KCNQ2/3), nonché alla neurofascina da 186 kDa, una molecola di adesione cellulare L1CAM. L'anchirina gigante-G si lega e recluta anche molecole di AIS citoplasmatiche tra cui beta-4-spectrin, e le proteine leganti i microtubuli, EB1/EB3 e Ndel1. L'anchirina gigante-G è sufficiente per salvare la formazione di AIS in neuroni carenti di anchirina-G. L'anchirina-G include anche un isoforma più piccolo da 190 kDa situato alle spine dendritiche invece dell'AIS, che non è in grado di mirare all'AIS o di salvare l'AIS in neuroni carenti di anchirina-G. Qui, abbiamo descritto un protocollo che utilizza neuroni ippocampali coltivati da topi ANK3-E22/23-flox, che, se trasfettato con Cre-BFP mostrano la perdita di tutta l'isoforma di anchirina-G e compromettono la formazione di AIS. Combinato un sistema di co-coltura Banker glia/neurone modificato, abbiamo sviluppato un metodo per trasfetto i neuroni nulli anchirina-G con un plasmide anchirina-G-GFP da 480 kDa, che è sufficiente per salvare la formazione di AIS. Utilizziamo inoltre un metodo di quantificazione, sviluppato da Salzer e colleghi per affrontare la variazione della distanza AIS dai corpi cellulari neuronali che si verifica nelle colture neuronali ippocampali. Questo protocollo consente studi quantitativi sull'assemblaggio de novo e sul comportamento dinamico dell'AIS.

Una serie completa di esperimenti dovrebbe includere la trasfezione solo Cre-BFP come controllo negativo, Cre-BFP più 480 kDa di co-trasfezione anchirina-G come controllo positivo e una condizione non trasfettata come controllo della tecnica. Nel controllo solo Cre-BFP, i neuroni trasfetti mancano dell'accumulo di marcatori AIS, tra cui anchirina-G (ankG), beta4-spectrina (β4), neurofascina (Nf) e canali di sodio gated di tensione (VSVG)(Figura 4A)16. Al contrario, ...

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Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Qui, abbiamo descritto un protocollo per studiare quantitativamente l'assemblaggio e la struttura dei segmenti iniziali di axon (AIS) dei neuroni ippocampali che mancano di AIS pre-assemblato a causa dell'assenza di un anchirina-G gigante.

Uso di neuroni ippocampali coltivati primari per studiare l'assemblaggio dei segmenti iniziali di Axon

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Questo protocollo è usato per studiare quantitativamente l'assemblaggio e la struttura dei segmenti iniziali dell'assone dei neuroni ippocampali che mancano di AIS pre-assemblato a causa dell'assenza di un'anchirina-G gigante. Per iniziare, seziona da sei a otto ippocampi da cuccioli postnatali di un giorno con mezzo HBSS in una piastra di Petri. Tritare gli ippocampi con forbici di dissezione in pezzi più piccoli e trasferirli dal piatto a un tubo da 15 millilitri.Lavare l'ippocampi due volte con cinque millilitri di HBSS e lasciarli in 4,5 millilitri di HBSS dopo il lavaggio. Aggiungere 0,5 millilitri di tripside al 2,5% in 4,5 millilitri di HBSS e incubare in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti, invertendo il tubo ogni cinque minuti. Gli ippocampi ben digeriti dovrebbero diventare appiccicosi e formare un ammasso.Se necessario, prolungare la digestione per altri cinque minuti. Lavare gli ippocampi con HBSS tre volte per cinque minuti per lavaggio. Dopo il lavaggio, aggiungere due millilitri di HBSS e pipettare l'ippocampi su e giù con una pipetta Pasteur 15 volte.Triturare il tessuto con una pipetta Pasteur lucidata dal fuoco 10 volte e riposare il tubo per cinque minuti fino a quando tutti i pezzi non sono impostati sul fondo. Ripetere la triturazione con i blocchi rimanenti fino a quando la maggior parte di essi non è scomparsa. Quindi, utilizzare una punta di pipetta da un millilitro per trasferire delicatamente il supernatante contenente i neuroni dissociati a piatti di placcatura.Aggiungerlo direttamente al mezzo di placcatura pre-incubato e agitare delicatamente la piastra. Da due a quattro ore dopo la semina, controllare i piatti di placcatura con un microscopio leggero. La maggior parte dei neuroni avrebbe dovuto attaccarsi allo scivolo di copertura.Utilizzando una punta fine, capovolgere la copertura scivola sulle stoviglie di alimentazione delle cellule gliali contenenti un mezzo di coltura neuronale precondizione con il lato dei punti di cera rivolto verso il basso. I neuroni possono crescere nei piatti di alimentazione delle cellule gliali per un massimo di un mese. Nutrire i neuroni ogni sette giorni con un millilitro di mezzo di coltura neuronale fresco.Il terzo giorno in vitro, capovolgere la copertura scivola con il lato del punto di cera rivolto verso l'alto in un piatto di alimentazione cellulare gliale con mezzo di coltura neuronale condizionato. Mescolare 0,25 microgrammi di DNA CRE BFP con 0,5 microgrammi di DNA GFP di anchirina-G in un tubo da 1,7 millilitri per trasfettare quattro scivolamenti di copertura. Aggiungere 100 microlitri ottimali.Quindi mescolare il tubo e poggiato su un rack. Se viene transfettato solo CRE BFP, la spina dorsale plasmotica GFP viene utilizzata per corrispondere alla quantità totale di DNA. Mescolare tre microlitri di reagente di trasfezione con 100 microlitri di optimum in un nuovo tubo da 1,7 millilitri e incubare il tubo per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi, mescolare 100 microlitri del DNA precedentemente miscelato con 100 microlitri di mix di reagenti di trasfezione e lasciarlo per cinque-10 minuti su un rack. Aggiungere 50 microlitri della miscela di DNA sopra ogni slittamento di copertura inserendo la punta appena sotto il mezzo senza toccare i foglietti di copertura. Pipetta lentamente per evitare di diffondere il mix di DNA.Riportare lentamente il piatto nell'incubatrice e lasciarlo lì per 30-45 minuti. Capovolgere la copertura scivola di nuovo verso il piatto di alimentazione gliale domestico con il lato a punti di cera rivolto verso il basso e rimettere il piatto nell'incubatrice. Per la quantificazione AIS, apri le immagini della serie Z nelle Fiji e genera una proiezione massima di immagini.Dopo aver sottratto il segnale di sfondo dello slittamento di copertura vuoto dall'immagine, disegnare una linea lungo l'AIS, assicurandosi che la larghezza della linea copra completamente l'AIS. Avviare la linea prima che il segnale AIS sia sollevato sopra lo sfondo e fermarsi dopo che è uscita in background. Misurare l'intensità media dei pixel lungo la linea ed esportarla in un foglio di calcolo.Quindi, eseguire uno script MATLAB per generare la figura finale. L'esperimento dovrebbe includere solo la trasfezione Cre-BFP come controllo negativo, Cre-BFP più 480 kilodalton anchirina-G cotrasfezione come controllo positivo, e una condizione non trasfettata come controllo della tecnica. Nel controllo solo Cre-BFP, i neuroni trasfetti mancano dell'accumulo di marcatori AIS, inclusi i canali di anchirina-G, beta 4 spectrin, neurofascina e sodio gated di tensione.Al contrario, i neuroni co-trasfetati Cre e 480 kilodalton ankyrin-G hanno completamente assemblato l'AIS, che è dimostrato dalla presenza di marcatori AIS. È importante confermare la qualità della cultura rispetto ai piatti non trasfetti. I neuroni malsani tendono a mostrare una struttura AIS anomala, come l'AIS fuori produzione o ectopica.Per valutare come una mutazione del disturbo del neurosviluppo umano anchirina-G influenzi l'assemblaggio AIS, l'intensità media dell'AIS è stata tracciata dal soma all'assone distale. Le proteine arricchite di AIS normalmente mostrano un rapido aumento del segnale dall'assone prossimale e una lenta diminuzione del segnale all'assone distale. Quando è allineata con l'AIS non trasfettato, la curva mutante è più ampia e il picco della curva è più basso, suggerendo un cambiamento di struttura dell'AIS.Il tipo selvaggio ankyrin-G assemblato AIS strettamente allineato con quello non trasfetto.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neuroscienze

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