Name: use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00
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우리는 신경 배양 프로토콜에 대한 제안에 대한 박사 게리 뱅커 에게 감사드립니다. 이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소에 의해 지원됩니다, NIH에서 보조금, 조지 바스 겔러는 교수를 부여 (V.B.).

참고: 산후 0일 ANK3-E22/23f/f 마우스에서 해마 뉴런의 이 배양 방법은 게리 뱅커의 glia/neuron 공동 배양 시스템에서 채택된다. 따라서 멸균 도구를 사용하여 깨끗한 후드에서 해부 후 모든 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 최대 1개월이 소요됩니다. 워크플로가 그림 3에표시됩니다. 이 프로토콜은 듀크 대학의 동물 지침을 따릅니다.
<p class="jove_...

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	<li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP.">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li><li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors.">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li><li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM.">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li><li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex.">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).</li><li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development.">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li><li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+activity+regulates+Na(+)+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment.">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability.">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li><li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon.">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li><li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Made+for+"anchorin":+Kv7.2/7.3+(KCNQ2/KCNQ3)+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons.">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing.">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li><li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier.">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G:+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling.">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin.">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment.">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly.">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li></ol>

AIS의 조립은 480 kDa ankyrin-G에 의해 조직된다. 그러나, ankyrin-G는 AIS 어셈블리의 구조 기능 분석의 해석에 어려움을 초래할 수 있는 야생형 뉴런의 AIS를 표적으로 할 수 있는 짧은 동소형을 갖는다. 여기서 우리는 AIS의 드 노보 조립의 연구를 허용하는 ANK3-E22/23-flox 마우스에서 뉴런을 사용하는 방법을 제시한다. 3 div에서 Cre-BFP와 변형함으로써, 우리는 ankyrin-G의 모든 내인성 동소형을 제...

축 사 초기 세그먼트는 대부분의 척추 동물 뉴런에서 근위 축 축 에 위치. 기능적으로 AIS는 이 지역의 전압 게이트 나트륨 채널의 고밀도로 인해 작업 전위가 시작되는 곳입니다. 일부 흥분 성 뉴런의 AIS는 또한 GABAergic 시냅스1,2,3형성을통해 억제 인터뉴런에 의해 표적화된다. 따라서 AIS는 세포 신호를 통합하고 뉴런의 흥분성을 조절하는 중요한 사이트입니다. AIS는 일반적으로 길이가 20-60 μm이며 세포 체체의 20 μm 내에 있습니다. AIS의 길이와 위치는 뇌 영역을 통해 뉴런뿐만 아니라 동일한 뉴런4,5의다른 발달 단계에서 다릅니다. 축적된 증거는 AIS의 조성및 위치가 뉴런 활동의 변화에 반응하는데 역동적인 것으로 나타났다4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G는 AIS의 마스터 오거나이저입니다. 480 kDa ankyrin-G는 전압 게이트 나트륨 채널뿐만 아니라 베타4-스펙트린, KCNQ2/3 채널을 포함한 다른 주요 AIS 단백질에 직접 결합하는 멤브레인 관련 어댑터 단백질로 나트륨 채널 활성8,9,및 186 kDa neurofascin, GABAergicssic을 직접 하는 L1CAM입니다. 480 kDa ankyrin-G는 짧은 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK 반복, 스펙트럼 결합 도메인, 규제 도메인)에서 발견되는 표준 앙키린 도메인을 공유하지만 척추 동물에서만 발견되며 뉴런(그림 1A)11,12에서구체적으로 표현되는 거대한 엑소로 구별됩니다. 480 kDa ankyrin-G 뉴런 특이 도메인(NSD)은 AIS형성(12)에필요하다. 190 kDa ankyrin-G는 ankyrin-G-null뉴런(12)에서AIS 어셈블리 또는 타겟 AIS를 촉진하지 않는다. 그러나, 190 kDa ankyrin-G는 480 kDa ankyrin-G12를포함하는 AIS에 집중된다. 190kDa ankyrin-G의 이러한 능력은 야생형 뉴런의 사전 조립된 AIS를 표적으로 하는 것이 문헌의 혼란의 원천이었으며 AIS 어셈블리에서 480kDa ankyrin-G의 중요한 전문 기능에 대한 인식을 늦추고 있다. 따라서 사전 조립된 AIS가 부족한 안키린-G-null 뉴런에서 AIS 어셈블리를 연구하는 것이 중요합니다.
여기서, 안키린-G13(도 1B)의모든 등색을 제거하는 ANK3-E22/23-flox 마우스로부터 배양된 해마 뉴런을 사용하여 AIS의 조립 및 구조를 연구하는 방법을 제시한다. AIS가 조립되기 전에 Cre-BFP 구조로 뉴런을 변형시킴으로써, 우리는 완전히 AIS(도 1B, 도 2)가부족한 ankyrin-G-결핍 뉴런을 생성했습니다. AIS의 조립은 Cre-BFP 플라스미드와 480 kDa ankyrin-G-GFP 플라스미드의 공동 변환에 따라 완전히 구출된다. 이 방법은 사전 조립되지 않은 AIS 환경에서 AIS 어셈블리를 연구하는 방법을 제공합니다. 또한 이전에 배아일 18뉴런을 위해 설계된 항생제를 사용하지 않고 게리 뱅커로부터 글리아-뉴런 공동 배양 시스템을 수정하여 산후 마우스 뉴런에 적용하고 AIS14,15의변이를 정상화하기 위해 여러 뉴런으로부터 AIS 측정을 평균하는 AIS 수량 방법을 적용하였다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18mm coverglass (1.5D)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-84-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#31059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Tripsin without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>480kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>lab made</td>
			<td>Provide upon request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANK3-E22/23f/f mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>Stock No: 029797</td>
			<td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer with 70-mm mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic coverslip-staining rack</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-BFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#128174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM with Earle&#8217;s salts and L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 70%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>225711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26124-78-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments

신경 축 축 하 초기 세그먼트 (AIS) 행동 잠재력의 개시의 사이트 이며 광범위 하 게 그들의 분자 구조대 한 연구 되었습니다., 조립 및 활동 의존가성 가소성. AIS의 마스터 오거나이저인 거대 앙키린-G는 멤브레인 스패닝 전압 게이트 나트륨(VSVG) 및 칼륨 채널(KCNQ2/3)과 L1CAM 세포 접착 분자인 186 kDa neurofascin과 직접 연결됩니다. 거대한 ankyrin-G는 또한 베타-4-spectrin및 microtubule 결합 단백질, EB1/EB3 및 Ndel1을 포함하여 세포질 AIS 분자를 결합하고 모집합니다. 거대한 ankyrin-G는 ankyrin-G 결핍 뉴런에서 AIS 형성을 구출하기에 충분합니다. Ankyrin-G는 또한 AIS를 대상으로 하거나 ankyrin-G-결핍 뉴런에서 AIS를 구출할 수 없는 AIS 대신 수지상 척추에 위치한 작은 190 kDa 이소형을 포함합니다. 여기서, 우리는 ANK3-E22/23-flox마우스에서 배양 해마 뉴런을 사용하여 프로토콜을 설명했는데, 이는 Cre-BFP로 감염될 때 안키린-G의 모든 동위체의 손실을 나타내고 AIS의 형성을 손상시킵니다. 수정된 뱅커 글리아/뉴런 공동 배양 시스템을 결합하여, AIS의 형성을 구출하기에 충분한 480kDa ankyrin-GFP 플라스미드로 안키린-G널 뉴런을 횡단하는 방법을 개발했습니다. 우리는 또한 해마 뉴런 배양에서 발생하는 신경 세포 체로부터AIS 거리의 변화를 처리하기 위해 Salzer와 동료에 의해 개발 된 정량화 방법을 사용합니다. 이 프로토콜을 사용하면 de novo 어셈블리의 정량적 연구와 AIS의 동적 동작을 허용합니다.

실험의 완전한 세트는 음성 제어로 Cre-BFP 만 트랜스페션을 포함해야, Cre-BFP 플러스 480 kDa ankyrin-G 는 양성 제어로 공동 트랜스페이션및 기술 제어로 비 이상 감염 상태를 포함한다. Cre-BFP 전용 대조군에서, 전감염된 뉴런은 ankyrin-G(ankG), 베타4-스펙트린(β4), 신경파신(Nf) 및 전압 게이트 나트륨 채널(VSVG)(도 4A)16을포함한 AIS 마커의 축적이 부족하다. 대조적으로...

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Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

여기서, 우리는 거대한 ankyrin-G의 부재로 인해 사전 조립된 AIS가 부족한 해마 뉴런의 축삭 초기 세그먼트(AIS)의 조립 및 구조를 정량적으로 연구하는 프로토콜을 기술하였다.

축 사 초기 세그먼트의 조립을 공부 하는 기본 배양 된 해마 뉴런의 사용

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

이 프로토콜은 거대한 ankyrin-G의 부재로 인해 사전 조립 된 AIS가 부족한 해마 뉴런의 축삭 초기 세그먼트의 조립 및 구조를 정량적으로 연구하는 데 사용됩니다. 우선, 태아에서 6~8개의 해마를 해부하고, 어느 날 페트리 접시에 HBSS 배지를 가진 오래된 새끼를 해부한다. 해부 가위로 해마를 잘라서 접시에서 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오.HBSS의 5 밀리리터로 해마를 두 번 씻고 세척 후 HBSS의 4.5 밀리리터로 둡니다. HBSS의 4.5 밀리리터에 2.5%의 트립신2.5%의 밀리리터를 넣고, 15분 동안 섭씨 37도의 수조에 배양하여 5분마다 튜브를 반전시릅니다. 잘 소화 된 해마는 끈적거리고 클러스터를 형성해야합니다.필요한 경우 소화를 5분 더 연장합니다. HBSS로 해마를 세척당 5분간 3회 세척합니다. 세척 후, HBSS의 두 밀리리터와 파이펫해마를 파스퇴르 파이펫으로 15번 위아래로 넣습니다.불을 연마한 파스퇴르 파이펫으로 조직을 10번 트리투레이하고 모든 덩어리가 바닥으로 바플 때까지 튜브를 5분간 쉬게 합니다. 나머지 청크로 트리튜레이션을 반복하면 대부분이 사라질 때까지 반복합니다. 그런 다음 1 밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 분리된 뉴런을 함유한 상체를 접시도금으로 부드럽게 전달합니다.사전 인큐베이션 도금 매체에 직접 추가하고 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다. 파종 후 2~4시간 후에는 가벼운 현미경으로 도금 요리를 확인하십시오. 뉴런의 대부분은 커버 슬립에 부착해야합니다.미세 한 팁 집게를 사용 하 여, 왁 스 점 측면 아래쪽으로 직면 하는 사전 조건된 신경 배양 매체를 포함 하는 신경 교 감 세포 공급 기 접시에 커버 슬립을 플립. 뉴런은 최대 한 달 동안 신경교 세포 피더 접시에서 성장할 수 있습니다. 신선한 신경 배양 배지의 1 밀리리터와 함께 7 일마다 뉴런을 공급합니다.체외에서 셋째 날에는 왁스 도트 측이 조절된 신경 배양 배지가 있는 신경 세포 피더 접시에 올려다보며 커버 슬립을 뒤집습니다. CRE BFP DNA0.25 마이크로그램과 ankyrin-GFP DNA0.5 마이크로그램을 1.7 밀리리터 튜브에 혼합하여 4개의 커버 슬립을 변형시킵니다. 최적의 100마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 튜브를 섞고 랙에 놓습니다. CRE BFP만 전염되는 경우, GFP 플라스믹 백본은 총 DNA 양과 일치하도록 사용된다. 새로운 1.7 밀리리터 튜브에 최적의 100 마이크로리터와 트랜스페션 시약 3개의 마이크로리터를 혼합하고 실온에서 5분 동안 튜브를 배양합니다.그런 다음 이전에 혼합된 DNA의 100마이크로리터를 100마이크로리터의 트랜스페션 시약 혼합물과 혼합하고 랙에 5~10분 동안 둡니다. 커버 슬립을 건드리지 않고 매질의 바로 아래에 팁을 삽입하여 각 커버 슬립 위에 DNA 믹스 50 마이크로리터를 추가합니다. 피펫은 DNA 혼합이 퍼지는 것을 피하기 위해 천천히.천천히 접시를 인큐베이터로 가져와 서 30-45 분 동안 그대로 둡니다. 커버를 홈 글리아피더 접시에 다시 뒤집어 왁스 도트 쪽을 아래로 향하고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다. AIS 정량화의 경우 피지의 Z 시리즈 이미지를 열고 이미지의 최대 투영을 생성합니다.이미지에서 빈 커버 슬립 배경 신호를 빼낸 후 AIS를 따라 선을 그려 줄너비가 AIS를 완전히 덮는지 확인합니다. AIS 신호가 배경 위로 올라오기 전에 선을 시작하고 배경으로 떨어뜨린 후 중지합니다. 선을 따라 평균 픽셀 강도를 측정하고 스프레드시트로 내보냅니다.그런 다음 MATLAB 스크립트를 실행하여 최종 그림을 생성합니다. 실험에는 부정적인 대조체로 Cre-BFP만 트랜스페션, Cre-BFP 플러스 480킬로달톤 ankyrin-G 응아를 양성 제어로, 기술 제어로서 비감염 상태를 포함해야 한다. Cre-BFP 전용 제어에서, 전감염된 뉴런은 ankyrin-G, 베타 4 스펙트린, 신경파신 및 전압 문이 있는 나트륨 채널을 포함하여 AIS 마커의 축적이 부족합니다.대조적으로, Cre 및 480 킬로달톤 ankyrin-G 공동 감염 된 뉴런은 AIS를 완전히 조립했으며, 이는 AIS 마커의 존재에 의해 입증된다. 비트랜스감염 된 요리와 비교하여 문화의 질을 확인하는 것이 중요합니다. 건강에 해로운 뉴런은 중단된 또는 자궁 AIS 같이 이상한 AIS 구조물을 보여주기 위하여 경향이 있습니다.ankyrin-G 인간 신경 발달 장애 돌연변이가 AIS 어셈블리에 미치는 영향을 평가하기 위해, 평균 AIS 강도는 황산 축삭에 소마에서 플롯되었다. AIS 농축 단백질은 일반적으로 근위 축축에서 신호의 빠른 증가와 해축 축하에 신호의 느린 감소를 보여줍니다. 비트랜스감염된 AIS와 정렬하면 돌연변이 곡선이 넓고 곡선의 피크가 낮아 AIS의 구조 변화를 암시합니다.야생형 앙키린-G는 AIS를 비트랜스감염된 것과 밀접하게 정렬하여 조립했다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

연구

신경과학

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 Hippocampal 뉴런의 단백질 Palmitoylation의 감지

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...