Name: use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

Vi takker Dr. Gary Banker for forslag om nevronkulturprotokoll. Dette arbeidet støttes av Howard Hughes Medical Institute, et stipend fra NIH, og et George Barth Geller-begavet professorat (V.B.).

MERK: Denne kulturmetoden for hippocampale nevroner fra postnatal 0-dagers ANK3-E22/23f/f mus er tilpasset Gary Bankers glia/neuron co-kultursystem. Derfor er det viktig å utføre alle trinn etter disseksjon i en ren hette ved hjelp av steriliserte verktøy. Denne protokollen tar opptil 1 måned. Arbeidsflyten vises i figur 3. Protokollen følger dyreretningslinjene til Duke University.
1. Forberedelse av deksler og nevronale plating retter
...

<ol>
	<li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP.">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li><li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors.">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li><li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM.">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li><li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex.">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).</li><li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development.">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li><li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+activity+regulates+Na(+)+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment.">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability.">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li><li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon.">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li><li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Made+for+"anchorin":+Kv7.2/7.3+(KCNQ2/KCNQ3)+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons.">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing.">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li><li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier.">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G:+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling.">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin.">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment.">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly.">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li></ol>

Samlingen av AIS er organisert av 480 kDa ankyrin-G. Ankyrin-G har imidlertid kortere isoformer som kan rette seg mot AIS av wildtype-nevroner, noe som kan føre til vanskeligheter med tolkning av strukturfunksjonsanalyser av AIS-montering. Her presenterer vi en metode ved hjelp av nevroner fra ANK3-E22/23-flox mus som tillater studie av de novo montering av AIS. Ved å transfektere med Cre-BFP ved 3 div, eliminerer vi alle endogene isoformer av ankyrin-G. Vi kunne også co-transfekt 480 kDa ankyrin-G f...

Axon innledende segmentet er plassert på proksimal axon i de fleste virveldyr nevroner. Funksjonelt er AIS der handlingspotensialer igangsettes på grunn av den høye tettheten av spenningsporterte natriumkanaler i denne regionen. AIS av noen eksitatoriske nevroner er også målrettet av hemmende internuroner gjennom å danne GABAergic synapser1,2,3. Derfor er AIS et kritisk sted for å integrere cellesignalering og modulere eksitabiliteten til nevroner. AIS er normalt 20-60 μm i lengde og ligger innenfor 20 μm av cellekroppen. Lengden og posisjonen til AIS varierer i nevroner på tvers av hjerneregioner, så vel som i forskjellige utviklingsstadier av samme nevron4,5. Akkumulerte bevis antydet at sammensetningen og posisjonen til AIS er dynamiske i å svare på endringen av nevronaktivitet4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G er hovedarrangør av AIS. 480 kDa ankyrin-G er et membran assosiert adapterprotein som direkte binder seg til spenningsportede natriumkanaler samt andre store AIS-proteiner, inkludert beta4-spektrin, KCNQ2/3 kanaler som modulerer natriumkanalaktivitet8,9og 186 kDa neurofascin, en L1CAM som leder GABAergic synapses til AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G deler kanoniske ankyrindomener som finnes i den korte 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK repetisjoner, spectrin binding domene, regulatorisk domene), men er preget av en gigantisk exon som bare finnes i vertebrater og er spesielt uttrykt i nevroner (Figur 1A)11,12. Det 480 kDa ankyrin-G nevronspesifikke domenet (NSD) er nødvendig forAIS-formasjon 12. 190 kDa ankyrin-G fremmer ikke AIS-montering eller mål-AIS i ankyrin-G-null nevroner12. Imidlertid er 190 kDa ankyrin-G konsentrert ved AIS som inneholder 480 kDa ankyrin-G12. Denne evnen til 190 kDa ankyrin-G til å målrette forhåndsmontert AIS av wildtype nevroner har vært en kilde til forvirring i litteraturen og har bremset verdsettelsen av de kritiske spesialiserte funksjonene til 480 kDa ankyrin-G i AIS-forsamlingen. Derfor er det viktig å studere AIS-montering i ankyrin-G-null nevroner som mangler en forhåndsmontert AIS.
Her presenterer vi en metode for å studere monteringen og strukturen til AIS ved hjelp av dyrkede hippocampale nevroner fra ANK3-E22/23-floxmus som eliminerer alle isoformer av ankyrin-G13 (Figur 1B). Ved å transfektere nevroner med en Cre-BFP-konstruksjon før AIS er montert, genererte vi ankyrin-G-mangelfulle nevroner som helt manglet en AIS (Figur 1B, Figur 2). Monteringen av AIS er fullt reddet etter co-transfection av 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid med en Cre-BFP plasmid. Med denne metoden kan du studere AIS-samlingen i et ikke-forhåndsmontert AIS-miljø. Vi modifiserte også glia-neuron co-kultursystemet fra Gary Banker uten å bruke antibiotika, tidligere designet for embryonale dag 18 nevroner, for søknad om postnatal mus nevroner og tilpasset en AIS-kvantitetsmetode for å gjennomsnittlige AIS-målinger fra flere nevroner for å normalisere variasjonen av AIS14,15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18mm coverglass (1.5D)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-84-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#31059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Tripsin without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>480kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>lab made</td>
			<td>Provide upon request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANK3-E22/23f/f mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>Stock No: 029797</td>
			<td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer with 70-mm mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic coverslip-staining rack</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-BFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#128174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM with Earle&#8217;s salts and L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 70%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>225711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26124-78-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments

Neuronal axon innledende segmenter (AIS) er steder for initiering av virkningspotensialer og har blitt grundig studert for deres molekylære struktur, montering og aktivitetsavhengig plastisitet. Giant ankyrin-G, hovedarrangøren av AIS, forbinder direkte med membran-spanning spenning gated natrium (VSVG) og kaliumkanaler (KCNQ2/3), samt 186 kDa neurofascin, en L1CAM celle vedheft molekyl. Giant ankyrin-G binder seg også til og rekrutterer cytoplasmatiske AIS-molekyler, inkludert beta-4-spectrin, og mikrotubulbindende proteiner, EB1/EB3 og Ndel1. Giant ankyrin-G er tilstrekkelig til å redde AIS-formasjon i ankyrin-G mangelfulle nevroner. Ankyrin-G inkluderer også en mindre 190 kDa isoform plassert ved dendritiske spines i stedet for AIS, som ikke er i stand til å målrette mot AIS eller redde AIS i ankyrin-G-mangelfulle nevroner. Her beskrev vi en protokoll ved hjelp av kultiverte hippocampale nevroner fra ANK3-E22/23-floxmus, som, når de ble transfektert med Cre-BFP, viser tap av all isoform av ankyrin-G og svekker dannelsen av AIS. Kombinert en modifisert Banker glia / neuron co-kultur system, utviklet vi en metode for å transfektere ankyrin-G null nevroner med en 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, som er tilstrekkelig til å redde dannelsen av AIS. Vi bruker videre en kvantifiseringsmetode, utviklet av Salzer og kolleger for å håndtere variasjon i AIS-avstand fra nevroncellelegemene som forekommer i hippocampale nevronkulturer. Denne protokollen tillater kvantitative studier av de novo-samlingen og dynamisk oppførsel av AIS.

Et komplett sett med eksperimenter bør inkludere Cre-BFP bare transfeksjon som negativ kontroll, Cre-BFP pluss 480 kDa ankyrin-G co-transfection som positiv kontroll og en ikke-transfektet tilstand som teknikkkontroll. I Cre-BFP bare kontroll mangler transfekterte nevroner akkumulering av AIS-markører, inkludert ankyrin-G (ankG), beta4-spectrin (β4), neurofascin (Nf) og spenningsporterte natriumkanaler (VSVG) (Figur 4A)16. Cre og 480 kDa ankyrin-G co-transfekerte n...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Her beskrev vi en protokoll for kvantitativt å studere montering og struktur av axon innledende segmenter (AIS) av hippocampal nevroner som mangler forhåndsmontert AIS på grunn av fravær av en gigantisk ankyrin-G.

Bruk av primærkulturerte hippocampale nevroner for å studere monteringen av axon-innledende segmenter

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Denne protokollen brukes til kvantitativt å studere montering og struktur av axon innledende segmenter av Hippocampal Neurons som mangler forhåndsmontert AIS på grunn av fravær av en gigantisk ankyrin-G. Til å begynne med, disseker seks til åtte hippocampi fra postnatal, en dag gamle valper med HBSS medium i en Petri-tallerken. Hakk hippocampi med disseksjon saks i mindre stykker, og overfør dem fra parabolen til et 15 milliliterrør.Vask hippocampi to ganger med fem milliliter HBSS, og la dem stå i 4,5 milliliter HBSS etter vasken. Tilsett 0,5 milliliter 2,5% trypsin i 4,5 milliliter HBSS, og inkuber i et 37 grader Celsius vannbad i 15 minutter, og inverter røret hvert femte minutt. Godt fordøyd hippocampi bør bli klebrig og danne en klynge.Om nødvendig, utvid fordøyelsen i fem minutter. Vask hippocampi med HBSS tre ganger i fem minutter per vask. Etter vasken, legg til to milliliter HBSS og pipette hippocampi opp og ned med en Pasteur pipette 15 ganger.Triturer vevet med en brannpolert Pasteur pipette 10 ganger, og hvil røret i fem minutter til alle biter er satt til bunnen. Gjenta triturasjonen med de resterende delene til de fleste av dem har forsvunnet. Bruk deretter en en milliliter pipettespiss for å forsiktig overføre supernatanten som inneholder de dissosierte nevronene til plating retter.Legg den direkte til det forhåndsinkuberte platingmediet og rist platen forsiktig. To til fire timer etter sådd, sjekk plating retter med et lett mikroskop. Flertallet av nevronene skal ha festet seg til dekkslippet.Bruk en fin spiss tang, snu dekselet glir til glial cellemater retter som inneholder precondition neuronal kultur medium med voks prikker side vendt nedover. Nevroner kan vokse i glialcellematerretter i opptil en måned. Fôr nevroner hver syvende dag med en milliliter fersk nevronkulturmedium.På den tredje dagen in vitro, snu dekselet slips med voks prikk side vendt opp i en glial celle feeder parabolen med betinget neuronal kultur medium. Bland 0,25 mikrogram CRE BFP DNA med 0,5 mikrogram ankyrin-G GFP DNA i et 1,7 milliliterrør for å transfektere fire dekselslipper. Tilsett 100 mikroliter optimalt.Bland deretter røret og hvilt på et stativ. Hvis bare CRE BFP er transfektert, brukes GFP plasmic ryggraden til å matche den totale mengden DNA. Bland tre mikroliter transfeksjonsreagens med 100 mikroliter optimalt i et nytt 1,7 milliliterrør og inkuber røret i fem minutter ved romtemperatur.Bland deretter 100 mikroliter av det tidligere blandede DNA-et med 100 mikroliter transfeksjonsreagensblanding, og la det stå i fem til ti minutter på et stativ. Tilsett 50 mikroliter av DNA-blandingen på toppen av hver dekselglidning ved å sette spissen like under mediet uten å berøre dekselskliene. Pipette sakte for å unngå å spre DNA-blandingen.Ta parabolen sakte tilbake til inkubatoren og la den stå der i 30 til 45 minutter. Vend dekselet tilbake til glialmaterfatet hjemme med voks prikksiden vendt ned og legg parabolen tilbake i inkubatoren. For AIS-kvantifisering åpner du Z-seriebildene i Fiji og genererer en maksimal projeksjon av bilder.Når du har trukket det tomme bakgrunnssignalet for dekselslipp fra bildet, tegner du en linje langs AIS, og kontrollerer at bredden på linjen dekker AIS fullstendig. Start linjen før AIS-signalet heves over bakgrunnen og stoppes etter at det faller til bakgrunnen. Mål gjennomsnittlig pikselintensitet langs linjen, og eksporter den til et regneark.Kjør deretter et MATLAB-skript for å generere den endelige figuren. Eksperimentet bør omfatte Cre-BFP bare transfeksjon som negativ kontroll, Cre-BFP pluss 480 kilodalton ankyrin-G cotransfection som positiv kontroll, og en ikke-transfektert tilstand som teknikkkontroll. I Cre-BFP-kontrollen mangler transfekterte nevroner akkumulering av AIS-markører, inkludert ankyrin-G, beta 4 spectrin, nevrofascin og spenningsporterte natriumkanaler.Cre og 480 kilodalton ankyrin-G co-transfekerte nevroner har derimot fullstendig montert AIS, som demonstreres ved tilstedeværelsen av AIS-markører. Det er viktig å bekrefte kvaliteten på kulturen via sammenligning med de ikke-transfekterte rettene. Usunne nevroner har en tendens til å vise unormal AIS-struktur, som utgått eller ektopisk AIS.For å evaluere hvordan en ankyrin-G human nevrodevelopmental lidelsesmutasjon påvirker AIS-montering, ble den gjennomsnittlige AIS-intensiteten plottet fra soma til distal axon. AIS-berikede proteiner viser normalt en rask økning av signalet fra den proksimale axonen og en langsom reduksjon av signalet til den distale axonen. Når den er justert etter den ikke-transfekterte AIS,er mutantkurven bredere og toppen av kurven er lavere, noe som tyder på en strukturendring av AIS.Den ville typen ankyrin-G montert AIS tett på linje med den ikke-transfected en.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk studie av Axon Regeneration med dyrkede Voksen røttene ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Påvisning av Protein palmitoylation i Cultured hippocampus neurons ved Immunoutfellingsanalyse og Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalsium Fosfat Transfection of Primary hippocampus nevroner

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Bruk av pHluorin for å vurdere dynamikken i Axon-veiledningsreseptorer i cellekultur og i chick-embryoet

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendrittutløperne av Rat Primary hippocampus nevroner bruker Strukturert Illumination Mikros

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...