Name: use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

Мы благодарим доктора Гэри Банкира за предложение по протоколу нейронной культуры. Эта работа поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза, грантом NIH и профессорским саном Джорджа Барта Геллера (V.B.).

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод культивирования нейронов гиппокампа из постнатальных 0-дневных мышей ANK3-E22/23f/f адаптирован из системы кокультуры глии/нейронов Гэри Банкира. Поэтому крайне важно выполнять все шаги после вскрытия в чистом вытяжке с использованием стерилизованных инст?...

<ol>
	<li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP.">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li><li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors.">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li><li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM.">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li><li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex.">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).</li><li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development.">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li><li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+activity+regulates+Na(+)+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment.">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability.">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li><li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon.">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li><li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Made+for+"anchorin":+Kv7.2/7.3+(KCNQ2/KCNQ3)+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons.">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing.">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li><li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier.">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G:+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling.">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin.">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment.">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly.">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li></ol>

Сборка АИС организована 480 кДа анкырин-Г. Однако анкирин-G имеет более короткие изоформы, которые могут нацеливаться на АИС нейронов дикого типа, что может привести к трудностям в интерпретации структурно-функционального анализа сборки АИС. Здесь мы представляем метод с использованием ...

Начальный сегмент аксона расположен в проксимальном аксоне в большинстве нейронов позвоночных. Функционально АИС - это место, где инициируются потенциалы действия из-за высокой плотности натриевых каналов с напряжением в этой области. АИС некоторых возбуждающих нейронов также нацелены на тормозные интернейроны путем образования ГАМКергических синапсов1,2,3. Таким образом, АИС является критическим участком для интеграции клеточной сигнализации и модуляции возбудимости нейронов. АИС обычно составляет 20-60 мкм в длину и расположена в пределах 20 мкм от тела клетки. Длина и положение АИС варьируется в нейронах по областям мозга, а также на разных стадиях развития одного и того женейрона4,5. Накопленные данные свидетельствуют о том, что состав и положение АИС динамичны в ответ на изменение активности нейронов4,5,6,7.
480 кДа анкырин-Г является мастер-организатором АИС. 480 кДа анкирин-G представляет собой мембранно-ассоциированный адапторный белок, который непосредственно связывается с напряжением закрытых натриевых каналов, а также с другими основными белками AIS, включая бета4-спектрин, каналы KCNQ2/3, которые модулируют активность натриевых каналов8,9и 186 кДа нейрофасцина, L1CAM, который направляет ГАМКергические синапсы к AIS2,10. 480 кДа анкирин-G разделяет канонические анкириновые домены, обнаруженные в короткой 190 кДа анкирин-G изоформе (ank repeats, спектрин-связывающий домен, регуляторный домен), но отличаются гигантским экзоном, который встречается только у позвоночных и специфически экспрессируется в нейронах(рисунок 1A)11,12. Специфический домен нейронов анкирин-G (НРД) 480 кДа необходим для формирования АИС12. 190 кДа анкирин-G не способствует сборке АИС и не нацеливает АИС в анкирин-G-нулевых нейронах12. Однако 190 кДа анкирина-Г сосредоточено на АИС, содержащей 480 кДа анкирина-Г12. Эта способность 190 кДа анкирина-G нацеливаться на предварительно собранную АИС нейронов дикого типа была источником путаницы в литературе и замедлила оценку критических специализированных функций 480 кДа анкирина-G в сборке АИС. Поэтому крайне важно изучать сборку АИС в анкирин-G-нулевых нейронах, в которым отсутствует предварительно собранная АИС.
Здесь мы представляем метод изучения сборки и структуры АИС с использованием культивируемых нейронов гиппокампа у мышей ANK3-E22/23-flox, который устраняет все изоформы анкирина-G13 (рисунок 1B). Трансфектируя нейроны с помощью конструкции Cre-BFP до сборки AIS, мы генерировали анкирин-G-дефицитные нейроны, полностью лишенные AIS(рисунок 1B, рисунок 2). Сборка АИС полностью спасена после совместной трансфекции плазмиды анкирин-G-GFP 480 кДа с плазмидой Cre-BFP. Этот метод обеспечивает способ изучения сборки АИС в несборной среде АИС. Мы также модифицировали систему кокультуры глиа-нейрон от Гэри Бэнкера без использования антибиотиков, ранее разработанную для эмбриональных нейронов 18-го дня, для применения к постнатальным нейронам мыши и адаптировали метод количественного определения АИС для усреднения измерений АИС от нескольких нейронов для нормализации вариации АИС14,15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18mm coverglass (1.5D)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-84-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#31059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Tripsin without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>480kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>lab made</td>
			<td>Provide upon request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANK3-E22/23f/f mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>Stock No: 029797</td>
			<td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer with 70-mm mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic coverslip-staining rack</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-BFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#128174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM with Earle&#8217;s salts and L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 70%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>225711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26124-78-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments

Начальные сегменты аксона нейронов (АИС) являются участками инициации потенциалов действия и были широко изучены на предмет их молекулярной структуры, сборки и пластичности, зависящей от активности. Гигантский анкирин-G, главный организатор АИС, напрямую ассоциируется с мембранными напряжениями закрытого натриевого (VSVG) и калиевого каналов (KCNQ2/3), а также с нейрофасцином 186 кДа, молекулой адгезии клеток L1CAM. Гигантский анкирин-G также связывается и рекрутирует цитоплазматические молекулы АИС, включая бета-4-спектрин, и микротрубочки-связывающие белки, EB1 / EB3 и Ndel1. Гигантского анкирина-G достаточно для спасения образования АИС в нейронах с дефицитом анкирина-G. Анкирин-G также включает меньшую изоформу 190 кДа, расположенную в дендритных шипах вместо АИС, которая не способна нацеливаться на АИС или спасать АИС в нейронах с дефицитом анкирина G. Здесь мы описали протокол с использованием культивируемых нейронов гиппокампа у мышей ANK3-E22/23-flox, которые при трансфекции Cre-BFP демонстрируют потерю всей изоформы анкирина-G и ухудшают образование АИС. Объединив модифицированную систему кокультуры глии и нейронов Банкира, мы разработали метод трансфектации анкирин-G нулевых нейронов с плазмидой 480 кДа анкирин-G-GFP, что достаточно для спасения образования АИС. Мы также используем метод количественной оценки, разработанный Зальцером и его коллегами для борьбы с изменением расстояния АИС от тел нейронных клеток, которое происходит в культурах нейронов гиппокампа. Этот протокол позволяет проводить количественные исследования сборки de novo и динамического поведения АИС.

Полный набор эксперимента должен включать только трансфекцию Cre-BFP в качестве отрицательного контроля, Cre-BFP плюс 480 кДа анкирин-G ко-трансфекцию в качестве положительного контроля и неперетерфраженное состояние в качестве контроля техники. В контроле только Cre-BFP трансфектированные ней?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Здесь мы описали протокол количественного изучения сборки и структуры исходных сегментов аксона (AIS) нейронов гиппокампа, в которых отсутствует предварительно собранная АИС из-за отсутствия гигантского анкирина-G.

Использование первичных культивированных нейронов гиппокампа для изучения сборки начальных сегментов аксона

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Этот протокол используется для количественного изучения сборки и структуры аксонных начальных сегментов нейронов гиппокампа, которым не хватает предварительно собранной АИС из-за отсутствия гигантского анкирина-G. Для начала рассекайте шесть-восемь гиппокампов от послеродовых, однодневных детенышей со средой HBSS в чашке Петри. Нарежьте гиппокампы ножницами для рассечения на более мелкие кусочки и переложите их из тарелки в 15-миллилитровую трубку.Дважды вымойте гиппокампы пятью миллилитрами HBSS, а после стирки оставьте их в 4,5 миллилитрах HBSS. Добавьте 0,5 миллилитра 2,5% трипсина в 4,5 миллилитра HBSS и высиживайте на водяной бане 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, переворачивая трубку каждые пять минут. Хорошо переваренные гиппокампы должны стать липкими и образовать скопление.При необходимости продлите пищеварение еще на пять минут. Мойте гиппокампы HBSS три раза в течение пяти минут за одну стирку. После стирки добавьте два миллилитра HBSS и пипетку гиппокампа вверх и вниз пипеткой Пастера 15 раз.Тритурировать ткань полированной огнем пипеткой Пастера 10 раз, и уложить трубку в течение пяти минут, пока все куски не улятся на дно. Повторяйте тритурацию с оставшимися кусками, пока большинство из них не исчезнут. Затем используйте наконечник пипетки в один миллилитр, чтобы аккуратно перенести супернатант, содержащий диссоциированные нейроны, на посуду.Добавьте его непосредственно в предварительно инкубированную гальваническое покрытие и аккуратно встряхните тарелку. Через два-четыре часа после посева проверьте посуду с помощью светового микроскопа. Большинство нейронов должны были прикрепиться к крышке.Используя тонкий наконечник щипцов, переверните крышку скользящей к посуде глиальных клеток, содержащей предварительно кондиционированную нейрональную культуральную среду с восковыми точками стороной вниз. Нейроны могут расти в глиальных клеточных кормушках до одного месяца. Питают нейроны каждые семь дней одним миллилитром свежей нейрональной питательной среды.На третий день in vitro переверните крышку, сдвинув восковой точечной стороной вверх в тарелку для подачи глиальных клеток с кондиционированной нейрональной питательной средой. Смешайте 0,25 микрограмма ДНК CRE BFP с 0,5 микрограммами ДНК ankyrin-G GFP в трубке размером 1,7 миллилитра для трансфектации четырех слипов крышки. Добавьте 100 микролитров оптимально.Затем перемешайте тюбик и полойте на стойку. Если трансфицируется только CRE BFP, плазменная основа GFP используется для сопоставления общего количества ДНК. Смешайте три микролитра трансфекционного реагента со 100 микролитрами оптимального в новой трубке размером 1,7 миллилитра и инкубируйте трубку в течение пяти минут при комнатной температуре.Затем смешайте 100 микролитров ранее смешанной ДНК со 100 микролитрами смеси трансфекционных реагентов и оставьте ее на пять-10 минут на стойке. Добавьте 50 микролитров смеси ДНК поверх каждого скольжения крышки, вставив наконечник чуть ниже среды, не касаясь слипов крышки. Пипетка медленно, чтобы избежать распространения смеси ДНК.Медленно принесите блюдо обратно в инкубатор и оставьте его там на 30-45 минут. Переверните крышку обратно к домашней тарелке глиальной кормушки с восковой точкой лицом вниз и положите блюдо обратно в инкубатор. Для количественной оценки АИС откройте изображения серии Z на Фиджи и сгенерируйте максимальную проекцию изображений.После вычитания из изображения фонового сигнала о скольжении пустой крышки нарисуйте линию вдоль АИС, убедившись, что ширина линии полностью покрывает АИС. Начните линию до того, как сигнал AIS будет поднят над фоном, и остановитесь после того, как он опустится на задний план. Измерьте среднюю интенсивность пикселей вдоль линии и экспортируйте ее в электронную таблицу.Затем запустите скрипт MATLAB, чтобы сгенерировать окончательную цифру. Эксперимент должен включать только трансфекцию Cre-BFP в качестве отрицательного контроля, Cre-BFP плюс котрансфекцию анкирина-G 480 килодалтонов в качестве положительного контроля и нетрансфектное состояние в качестве контроля техники. В контроле только Cre-BFP трансфектным нейронам не хватает накопления маркеров АИС, включая анкирин-G, бета-4 спектрин, нейрофасцин и натриевые каналы с напряжением.Напротив, ко-трансфефицированные нейроны Cre и 480 килодалтонов анкирин-G имеют полностью собранную АИС, что демонстрируется наличием маркеров АИС. Важно подтвердить качество культуры путем сравнения с неперераженными блюдами. Нездоровые нейроны, как правило, демонстрируют аномальную структуру АИС, такую как прекращенная или эктопическая АИС.Чтобы оценить, как мутация расстройства нервного развития человека анкирин-G влияет на сборку АИС, средняя интенсивность АИС была построена на графике от сомы до дистального аксона. Белки, обогащенные АИС, обычно показывают быстрое увеличение сигнала от проксимального аксона и медленное снижение сигнала к дистальным аксону. При выравнивании с неперефраженной АИС мутантная кривая шире, а пик кривой ниже, что предполагает изменение структуры АИС.Дикий тип анкирин-G собран АИС тесно связан с неперераженным.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection и первичной культуры эмбриональных Мышь гиппокампа и корковых нейронов

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) флуоресценции меткой Белки в Дендритные Шипы культивированный нейронов гиппокампа

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Генетическое изучение регенерации аксонов с искусственного взрослых нейронов ганглиев

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

PHluorin изображений с метками рецепторов вставки в плазматическую мембрану в первичной культуре нейронов мыши

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Обнаружение белка Palmitoylation в культуре нейронов гиппокампа на Иммунопреципитация и ацил-биотин бирже (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Фосфат кальция Трансфекцию первичной нейронов гиппокампа

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Использование рГлуорин для оценки динамики аксонов Руководящие рецепторы в клеточной культуре и в Чик эмбриона

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Визуализация дендритных шипиков крысы первичной нейронов гиппокампа с помощью структурированного подсветки микроскопия

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...