Name: use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00
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Agradecemos al Dr. Gary Banker por su sugerencia sobre el protocolo de cultivo neuronal. Este trabajo cuenta con el apoyo del Instituto Médico Howard Hughes, una subvención de los NIH y una cátedra (V.B.

NOTA: Este método de cultivo de neuronas del hipocampo de ratones postnatales de 0 días ANK3-E22/23f/f está adaptado del sistema de co-cultivo de glía/neurona de Gary Banker. Por lo tanto, es fundamental realizar todos los pasos después de la disección en una campana limpia utilizando herramientas esterilizadas. Este protocolo tarda hasta 1 mes. El flujo de trabajo se muestra en la figura 3. El protocolo sigue las pautas animales de la Universidad de Duke.
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	<li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP.">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li><li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors.">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li><li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM.">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li><li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex.">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).</li><li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development.">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li><li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+activity+regulates+Na(+)+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment.">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability.">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li><li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon.">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li><li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Made+for+"anchorin":+Kv7.2/7.3+(KCNQ2/KCNQ3)+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons.">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing.">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li><li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier.">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G:+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling.">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin.">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment.">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly.">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li></ol>

El montaje de AIS está organizado por 480 kDa ankyrin-G. Sin embargo, la anquirona-G tiene isoformas más cortas que pueden apuntar al AIS de las neuronas de tipo salvaje, lo que puede conducir a la dificultad en la interpretación de los análisis de estructura-función del ensamblaje de AIS. Aquí presentamos un método utilizando neuronas de ratones ANK3-E22/23-flox que permite el estudio del ensamblaje de novo del AIS. Al transfectar con Cre-BFP a 3 div, eliminamos todas las isoformas endógenas d...

El segmento inicial del axón se encuentra en el axón proximal en la mayoría de las neuronas vertebradas. Funcionalmente, AIS es donde se inician los potenciales de acción debido a la alta densidad de canales de sodio bloqueados por voltaje en esta región. Los AIS de algunas neuronas excitatorias también son atacados por interneuronas inhibitorias a través de la formación de sinapsis GABAérgicas1,2,3. Por lo tanto, AIS es un sitio crítico para integrar la señalización celular y modular la excitabilidad de las neuronas. AIS es normalmente 20-60 μm de longitud y situado dentro de 20 μm del cuerpo celular. La longitud y posición de AIS varía en las neuronas a través de las regiones del cerebro, así como en diferentes etapas de desarrollo de la misma neurona4,5. La evidencia acumulada sugiere que la composición y la posición del SIA son dinámicas en respuesta al cambio de la actividad neuronal4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G es el organizador maestro de AIS. 480 kDa ankyrin-G es una proteína adaptadora asociada a la membrana que se une directamente a los canales de sodio bloqueados por voltaje, así como a otras proteínas AIS importantes, incluidos los canales beta4-spectrin, KCNQ2/3 que modulan la actividad del canal de sodio8,9,y 186 kDa neurofascin, un L1CAM que dirige las sinapsis GABAérgicas al AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G comparte dominios canónicos de ankyrin encontrados en la isoforma corta de ankyrin-G de 190 kDa (repeticiones DE ANK, dominio de unión a spectrin, dominio regulador), pero se distinguen por un exón gigante que se encuentra solo en vertebrados y se expresa específicamente en neuronas(Figura 1A)11,12. El dominio específico de la neurona ankyrin-G de 480 kDa (NSD) se requiere para la formación de AIS12. La ankyrin-G de 190 kDa no promueve el ensamblaje de AIS ni se dirige a AIS en neuronas ankyrin-G-null12. Sin embargo, 190 kDa ankyrin-G se concentra en el AIS que contiene 480 kDa ankyrin-G12. Esta capacidad de la anquirina-G de 190 kDa para apuntar a AIS premontado de neuronas de tipo salvaje ha sido una fuente de confusión en la literatura y ha ralentizado la apreciación de las funciones especializadas críticas de la anquirina-G de 480 kDa en el ensamblaje de AIS. Por lo tanto, es fundamental estudiar el ensamblaje de AIS en neuronas ankyrin-G-null que carecen de un AIS preensamblado.
Aquí, presentamos un método para estudiar el ensamblaje y la estructura del AIS utilizando neuronas hippocampales cultivadas de ratones ANK3-E22/23-flox que elimina todas las isoformas de ankyrin-G13 (Figura 1B). Transfectando neuronas con una construcción Cre-BFP antes de que se ensase el AIS, generamos neuronas deficientes en anquirina-G que carecían completamente de un AIS(Figura 1B, Figura 2). El ensamblaje de AIS se rescata completamente después de la co-transfección del plásmido de anquirina-G-GFP de 480 kDa con un plásmido Cre-BFP. Este método proporciona una manera de estudiar el ensamblado AIS en un entorno AIS no premontado. También modificamos el sistema de co-cultivo de glía-neurona de Gary Banker sin usar antibióticos, previamente diseñado para neuronas embrionarias de día 18, para su aplicación a neuronas de ratón postnatales y adaptamos un método de cuantificación AIS a las mediciones promedio de AIS de múltiples neuronas para normalizar la variación de AIS14,15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18mm coverglass (1.5D)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-84-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#31059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Tripsin without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>480kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>lab made</td>
			<td>Provide upon request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANK3-E22/23f/f mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>Stock No: 029797</td>
			<td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer with 70-mm mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic coverslip-staining rack</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-BFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#128174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM with Earle&#8217;s salts and L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 70%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>225711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26124-78-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments

Los segmentos iniciales de axones neuronales (AIS) son sitios de iniciación de potenciales de acción y han sido ampliamente estudiados por su estructura molecular, ensamblaje y plasticidad dependiente de la actividad. Ankyrin-G gigante, el organizador principal de AIS, asocia directamente con el voltaje membrana-que atraviesa el sodio bloqueado (VSVG) y los canales del potasio (KCNQ2/3), así como el neurofascin 186 del kDa, una molécula de la adherencia de célula de L1CAM. Ankyrin-G gigante también ata a y recluta las moléculas citoplásmicas de AIS incluyendo beta-4-spectrin, y las proteínas microtubule-obligatoria, EB1/EB3 y Ndel1. Ankyrin-G gigante es suficiente rescatar la formación de AIS en neuronas deficientes de ankyrin-G. Ankyrin-G también incluye una isoforma más pequeña de 190 kDa situada en las espinas dendríticas en vez del AIS, que es incapaz de apuntar al AIS o de rescatar el AIS en neuronas ankyrin-G-deficientes. Aquí, se describe un protocolo utilizando neuronas del hipocampo cultivadas de ANK3-E22/23-flox ratones, que, cuando se transfecta con Cre-BFP exhiben la pérdida de toda la isoforma de la anquirina-G y deteriorar la formación de AIS. Combinado un sistema modificado de glía de Banker / neurona co-cultivo, hemos desarrollado un método para transfectar ankyrin-G neuronas nulas con un 480 kDa ankyrin-G-GFP plásmido, que es suficiente para rescatar la formación de AIS. Además, empleamos un método de cuantificación, desarrollado por Salzer y sus colegas para hacer frente a la variación en la distancia AIS de los cuerpos celulares neuronales que se produce en los cultivos de neuronas del hipocampo. Este protocolo permite realizar estudios cuantitativos del ensamblaje de novo y del comportamiento dinámico del AIS.

Un conjunto completo de experimentos debe incluir la transfección de Cre-BFP solamente como control negativo, Cre-BFP más la co-transfección de ankyrin-G de 480 kDa como control positivo y una condición no transfectada como control de la técnica. En el control sólo de Cre-BFP, las neuronas transfectadas carecen de la acumulación de marcadores AIS, incluyendo anquirina-G (ankG), beta4-espectrina (β4), neurofascina (Nf) y canales de sodio bloqueados por voltaje (VSVG) (Figura 4A)<sup c...

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Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Aquí, se describe un protocolo para estudiar cuantitativamente el montaje y la estructura de los segmentos iniciales de axones (AIS) de las neuronas del hipocampo que carecen de AIS pre-montado debido a la ausencia de una anquiria gigante-G.

Uso De Las Neuronas Del Hipocampo Cultivadas Primarias Para Estudiar El Ensamblaje De Los Segmentos Iniciales Axón

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Este protocolo se utiliza para estudiar cuantitativamente el ensamblaje y la estructura de los segmentos iniciales de axones de las neuronas del hipocampo que carecen de AIS preensamblado debido a la ausencia de una anquilona-G gigante. Para empezar, diseccione de seis a ocho hipocampos de postnatal, cachorros de un día de edad con medio HBSS en una placa de Petri. Picar los hipocampos con tijeras de disección en trozos más pequeños, y transferirlos desde el plato a un tubo de 15 mililitros.Lave el hipocampo dos veces con cinco mililitros de HBSS y déjelos en 4.5 mililitros de HBSS después del lavado. Agregue 0.5 mililitros de tripsina al 2.5% en 4.5 mililitros de HBSS e incube en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 15 minutos, invirtiendo el tubo cada cinco minutos. Los hipocampos bien digeridos deben volverse pegajosos y formar un grupo.Si es necesario, extienda la digestión durante cinco minutos más. Lave los hipocampos con HBSS tres veces durante cinco minutos por lavado. Después del lavado, añadir dos mililitros de HBSS y pipetear el hipocampo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur 15 veces.Triturar el tejido con una pipeta Pasteur pulida al fuego 10 veces, y descansar el tubo durante cinco minutos hasta que todos los trozos se establecen en el fondo. Repita la trituración con los trozos restantes hasta que la mayoría de ellos hayan desaparecido. Luego, use una punta de pipeta de un mililitro para transferir suavemente el sobrenadante que contiene las neuronas disociadas a los platos de chapado.Añadirlo directamente al medio de chapado preincubado y agitar la placa suavemente. Dos a cuatro horas después de la siembra, revise los platos de chapado con un microscopio de luz. La mayoría de las neuronas deben haber unido a la resbalón de la cubierta.Usando un fórceps de punta fina, voltee los resbalones de la cubierta a los platos del alimentador de células gliales que contienen un medio de cultivo neuronal precondicionado con los puntos de cera hacia el lado hacia abajo. Las neuronas pueden crecer en los platos de alimentación de células gliales hasta por un mes. Alimentar a las neuronas cada siete días con un mililitro de medio de cultivo neuronal fresco.En el tercer día in vitro, voltear la cubierta se desliza con el lado del punto de cera hacia arriba en un plato alimentador de células gliales con medio de cultivo neuronal acondicionado. Mezcle 0,25 microgramos de ADN CRE BFP con 0,5 microgramos de ADN ankyrin-G GFP en un tubo de 1,7 mililitros para transfectar cuatro resbalones de cubierta. Añadir 100 microlitros óptimos.A continuación, mezclar el tubo y descansado en un bastidor. Si sólo se transfecta cre BFP, la columna vertebral plásmica GFP se utiliza para que coincida con la cantidad total de ADN. Mezcle tres microlitros de reactivo de transfección con 100 microlitros de óptimo en un nuevo tubo de 1,7 mililitros e incube el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego, mezcle 100 microlitros del ADN previamente mezclado con 100 microlitros de mezcla de reactivos de transfección y déjelo durante cinco a 10 minutos en un estante. Agregue 50 microlitros de la mezcla de ADN en la parte superior de cada resbalón de la cubierta insertando la punta justo debajo del medio sin tocar los resbalones de la cubierta. Pipetee lentamente para evitar la propagación de la mezcla de ADN.Lleve lentamente el plato de vuelta a la incubadora y déjelo allí durante 30 a 45 minutos. Voltear la cubierta se desliza de nuevo al plato de alimentación glial de casa con el lado del punto de cera hacia abajo y poner el plato de nuevo en la incubadora. Para la cuantificación de AIS, abra las imágenes de la serie Z en Fiji y genere una proyección máxima de imágenes.Después de restar la señal de fondo de deslizamiento de la cubierta vacía de la imagen, dibuje una línea a lo largo del AIS, asegurándose de que el ancho de la línea cubra completamente el AIS. Comience la línea antes de que la señal AIS se eleve sobre el fondo y pare después de que caiga al fondo. Mida la intensidad media de píxeles a lo largo de la línea y expórtela a una hoja de cálculo.A continuación, ejecute un script MATLAB para generar la figura final. El experimento debe incluir cre-BFP sólo transfección como control negativo, Cre-BFP más 480 kilodalton ankyrin-G cotransfection como control positivo, y una condición no transfectada como control de la técnica. En el control de Cre-BFP solamente, las neuronas transfectadas carecen de la acumulación de marcadores de AIS, incluyendo ankyrin-G, beta 4 spectrin, neurofascin, y canales de sodio bloqueados voltaje.En contraste, Cre y 480 kilodalton ankyrin-G co-transfected neuronas han montado completamente AIS, que se demuestra por la presencia de marcadores AIS. Es importante confirmar la calidad del cultivo a través de la comparación con los platos no transfectados. Las neuronas no saludables tienden a mostrar una estructura anormal de AIS, como AIS descontinuado o ectópico.Para evaluar cómo una mutación humana del desorden del neurodevelopmental del ankyrin-G afecta a la asamblea del AIS, la intensidad media del AIS fue trazada del soma al axón distal. Las proteínas enriquecidas con AIS normalmente muestran un rápido aumento de la señal del axón proximal y una disminución lenta de la señal al axón distal. Cuando se alinea con el AIS no transfectado, la curva mutante es más ancha y el pico de la curva es menor, lo que sugiere un cambio de estructura de AIS.El tipo salvaje ankyrin-G ensambló AIS alineado estrechamente con el no transfectado.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Investigación

Neurociencias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Fosfato de Calcio La transfección de Primaria neuronas del hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Uso De pHluorin Para Evaluar La Dinámica De Los Receptores De Orientación Axón En El Cultivo Celular Y En El Embrión De Polluelo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...