Name: use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

Vi tackar dr Gary Banker för förslaget om neuronal kulturprotokoll. Detta arbete stöds av Howard Hughes Medical Institute, ett anslag från NIH, och en George Barth Geller utrustad professur (V.B.).

OBS: Denna kulturmetod för hippocampala nervceller från postnatala 0-dagars ANK3-E22/23f/f möss är anpassad från Gary Bankers glia / neuron co-culture system. Därför är det viktigt att utföra alla steg efter dissekering i en ren huva med steriliserade verktyg. Det här protokollet tar upp till 1 månad. Arbetsflödet visas i bild 3. Protokollet följer Duke Universitys djurriktlinjer.
1. Förberedelse av täckglas och neuronala pläterin...

<ol>
	<li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP.">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li><li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors.">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li><li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM.">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li><li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex.">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).</li><li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development.">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li><li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+activity+regulates+Na(+)+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment.">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability.">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li><li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon.">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li><li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Made+for+"anchorin":+Kv7.2/7.3+(KCNQ2/KCNQ3)+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons.">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing.">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li><li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier.">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+ankyrin-G:+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling.">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li><li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin.">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment.">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly.">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li></ol>

Monteringen av AIS organiseras av 480 kDa ankyrin-G. Ankyrin-G har dock kortare isoformer som kan rikta sig till AIS av vilda nervceller, vilket kan leda till svårigheter att tolka struktur-funktion analyser av AIS montering. Här presenterar vi en metod med hjälp av nervceller från ANK3-E22/23-flox möss som möjliggör studier av de novo montering av AIS. Genom att transfectera med Cre-BFP vid 3 div eliminerar vi alla endogena isoformer av ankyrin-G. Vi kan också samtransfektera 480 kDa ankyrin-G ...

Axon initiala segmentet ligger vid proximala axon i de flesta ryggradsdjur nervceller. Funktionellt är AIS där åtgärdspotentialer initieras på grund av hög densitet av spännings-gated natriumkanaler i denna region. AIS av vissa excitatoriska nervceller är också riktade av hämmande interneuroner genom att bilda GABAergic synapser1,2,3. Därför är AIS en kritisk plats för att integrera cellsignalering och modulera nervcellers excitabilitet. AIS är normalt 20-60 μm lång och ligger inom 20 μm från cellkroppen. Längden och positionen för AIS varierar i nervceller över hjärnregioner, liksom i olika utvecklingsstadier av samma neuron4,5. Ackumulerade bevis föreslog att sammansättningen och positionen av AIS är dynamiska för att svara på förändringen av neuronal aktivitet4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G är mästararrangör av AIS. 480 kDa ankyrin-G är ett membran associerat adapterprotein som direkt binder till spänningsgrindade natriumkanaler samt andra stora AIS-proteiner inklusive beta4-spektrin, KCNQ2/3-kanaler som modulerar natriumkanalaktivitet8,9och 186 kDa neurofascin, en L1CAM som leder GABAergic synapser till AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G delar kanoniska ankyrindomäner som finns i de korta 190 kDa ankyrin-G-isoformen (ANK upprepar, spektrinbindningsdomän, regulatorisk domän), men utmärks av en jätte exon som endast finns i ryggradsdjur och uttrycks specifikt i nervceller (Figur 1A)11,12. Den 480 kDa ankyrin-G neuron specifika domänen (NSD) krävs för AIS-formation12. 190 kDa ankyrin-G främjar inte AIS montering eller mål AIS i ankyrin-G-null nervceller12. 190 kDa ankyrin-G är dock koncentrerat till AIS som innehåller 480 kDa ankyrin-G12. Denna förmåga hos 190 kDa ankyrin-G att rikta in sig på förmonterade AIS av wildtype nervceller har varit en källa till förvirring i litteraturen och har bromsat uppskattningen av de kritiska specialiserade funktionerna i 480 kDa ankyrin-G i AIS montering. Därför är det viktigt att studera AIS montering i ankyrin-G-null nervceller som saknar en förmonterad AIS.
Här presenterar vi en metod för att studera AIS montering och struktur med hjälp av odlade hippocampal neuroner från ANK3-E22/23-flox möss som eliminerar alla isoformer av ankyrin-G13 (Figur 1B). Genom att transfectera nervceller med en Cre-BFP-konstruktion innan AIS monteras genererade vi ankyrin-G-bristfälliga nervceller som helt saknade en AIS (Figur 1B, Figur 2). Monteringen av AIS är helt räddad efter samtransfection av 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid med en Cre-BFP plasmid. Den här metoden är ett sätt att studera AIS-sammansättningen i en icke-förmonterad AIS-miljö. Vi modifierade också glia-neuron co-culture system från Gary Banker utan att använda antibiotika, tidigare utformad för embryonala dag 18 nervceller, för tillämpning på postnatala mus nervcellerochanpassade en AIS kvantifieringsmetod för att genomsnittliga AIS mätningar från flera nervceller att normalisera variationen av AIS14,15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18mm coverglass (1.5D)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-84-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#31059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Tripsin without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>480kDa ankyrin-G-GFP</td>
			<td>lab made</td>
			<td>Provide upon request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANK3-E22/23f/f mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>Stock No: 029797</td>
			<td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer with 70-mm mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic coverslip-staining rack</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-BFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#128174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM with Earle&#8217;s salts and L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 70%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>225711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26124-78-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of primary cultured hippocampal neurons to study the assembly of axon initial segments

Neuronal axon initiala segment (AIS) är platser för inledande av åtgärder potentialer och har studerats utförligt för deras molekylära struktur, montering och aktivitet-beroende plasticitet. Giant ankyrin-G, huvudarrangören av AIS, associerar direkt med membranspäckad spänning gated natrium (VSVG) och kaliumkanaler (KCNQ2/3), samt 186 kDa neurofascin, en L1CAM cell vidhäftningsmolekyl. Giant ankyrin-G binder också till och rekryterar cytoplasmiska AIS-molekyler inklusive beta-4-spektrin och mikrotubulebindande proteiner, EB1/EB3 och Ndel1. Jätte ankyrin-G är tillräckligt för att rädda AIS-formationen i ankyrin-G bristfälliga nervceller. Ankyrin-G innehåller också en mindre 190 kDa isoform belägen vid dendritiska ryggraden istället för AIS, som inte kan rikta sig till AIS eller rädda AIS i ankyrin-G-bristfälliga nervceller. Här beskrev vi ett protokoll med odlade hippocampal nervceller från ANK3-E22/23-flox möss, som, när transfected med Cre-BFP uppvisar förlust av all isoform av ankyrin-G och försämra bildandet av AIS. Tillsammans ett modifierat Banker glia/neuron co-culture system utvecklade vi en metod för att transfect ankyrin-G null nervceller med en 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, vilket är tillräckligt för att rädda bildandet av AIS. Vi använder vidare en kvantifieringsmetod, utvecklad av Salzer och kollegor för att hantera variationer i AIS avstånd från de neuronala cellkroppar som förekommer i hippocampala neuronkulturer. Detta protokoll tillåter kvantitativa studier av de novo montering och dynamiskt beteende av AIS.

En komplett uppsättning experiment bör omfatta Cre-BFP endast transfection som negativ kontroll, Cre-BFP plus 480 kDa ankyrin-G co-transfection som positiv kontroll och ett icke-transfecterat tillstånd som teknikkontroll. I endast Cre-BFP-kontroll saknar transfekterade nervceller ackumulering av AIS-markörer, inklusive ankyrin-G (ankG), beta4-spektrin (β4), neurofascin (Nf) och spänningsgrindade natriumkanaler (VSVG) (Figur 4A)16. Cre och 480 kDa ankyrin-G co-tr...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments at JoVE.com

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Här beskrev vi ett protokoll för att kvantitativt studera montering och struktur av axon initiala segment (AIS) av hippocampal nervceller som saknar förmonterade AIS på grund av avsaknaden av en jätte ankyrin-G.

Användning av primär kultiverade hippocampala nervceller för att studera monteringen av Axon initiala segment

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Detta protokoll används för att kvantitativt studera montering och struktur av axon initiala segment av Hippocampal Neurons som saknar förmonterade AIS på grund av avsaknaden av en jätte ankyrin-G. Till att börja med dissekera sex till åtta hippocampi från postnatala, en dag gamla valpar med HBSS medium i en Petri-maträtt. Hacka hippocampi med dissekeringssax i mindre bitar och överför dem från skålen till ett 15 milliliter rör.Tvätta hippocampi två gånger med fem milliliter HBSS och lämna dem i 4,5 milliliter HBSS efter tvätten. Tillsätt 0,5 milliliter 2,5% trypsin i 4,5 milliliter HBSS och inkubera i ett 37 grader Celsius vattenbad i 15 minuter, vänd röret var femte minut. Välsmält hippocampi bör bli klibbig och bilda ett kluster.Om det behövs, förläng matsmältningen i ytterligare fem minuter. Tvätta hippocampi med HBSS tre gånger i fem minuter per tvätt. Efter tvätten, tillsätt två milliliter HBSS och pipett hippocampi upp och ner med en Pasteur pipett 15 gånger.Triturera vävnaden med en brandpolerad Pasteur-pipett 10 gånger och vila röret i fem minuter tills alla bitar är inställda på botten. Upprepa tritureringen med de återstående bitarna tills de flesta av dem har försvunnit. Använd sedan en en milliliter pipettspets för att försiktigt överföra supernatanten som innehåller de dissocierade nervcellerna till pläteringsfat.Tillsätt det direkt till det förinkuberade pläteringsmediet och skaka plattan försiktigt. Två till fyra timmar efter sådd, kontrollera pläteringsfaten med ett lätt mikroskop. Majoriteten av nervcellerna borde ha fäst på täcksnederetten.Med hjälp av en fin spets tång, vänd locket glider till gliacellmatarfat som innehåller förkonditionerat neuronalt odlingsmedium med vaxpängsidan vänd nedåt. Neuroner kan växa i glialcellmatarrätterna i upp till en månad. Mata nervceller var sjunde dag med en milliliter färskt neuronalt odlingsmedium.På den tredje dagen in vitro, vänd locket glider med vax prick sidan vänd upp i en glial cell matare skål med konditionerade neuronal kultur medium. Blanda 0,25 mikrogram CRE BFP DNA med 0,5 mikrogram ankyrin-GFP DNA i ett 1,7 milliliterrör för att transfektera fyra täckslipsar. Tillsätt 100 mikroliter optimalt.Blanda sedan röret och vila på ett rack. Om endast CRE BFP transfecteras används GFP-plasmiska ryggraden för att matcha den totala mängden DNA. Blanda tre mikroliter transfection reagens med 100 mikroliter optimalt i ett nytt 1,7 milliliter rör och inkubera röret i fem minuter vid rumstemperatur.Blanda sedan 100 mikroliter av det tidigare blandade DNA med 100 mikroliter transfection reagensblandning och lämna det i fem till 10 minuter på ett rack. Tillsätt 50 mikroliter AV DNA-blandningen ovanpå varje täckslip genom att sätta in spetsen precis under mediet utan att vidröra täckslirorna. Pipett långsamt för att undvika spridning av DNA-blandningen.Ta långsamt tillbaka skålen till inkubatorn och lämna den där i 30 till 45 minuter. Vänd locket glider tillbaka till hem glialmatarformen med vaxpingsidan vänd nedåt och lägg tillbaka skålen i inkubatorn. För AIS-kvantifiering öppnar du Z-seriens bilder i Fiji och genererar en maximal projektion av bilder.När du har subtrahera bakgrundssignalen för tom omslagsglidning från bilden ritar du en linje längs AIS och ser till att linjens bredd helt täcker AIS. Starta linjen innan AIS-signalen höjs ovanför bakgrunden och stoppas när den faller till bakgrunden. Mät medelpixelintensiteten längs linjen och exportera den till ett kalkylblad.Kör sedan ett MATLAB-skript för att generera den slutliga figuren. Experimentet bör omfatta Endast Cre-BFP-transfection som negativ kontroll, Cre-BFP plus 480 kilodalton ankyrin-G cotransfection som positiv kontroll och ett icke-transfecterat tillstånd som teknikkontroll. I Cre-BFP endast kontroll, transfected nervceller saknar ackumulering av AIS markörer, inklusive ankyrin-G, beta 4 spektrin, neurofascin och spänning gated natrium kanaler.Cre och 480 kilodalton ankyrin-G co-transfected nervceller har däremot helt monterat AIS, vilket framgår av förekomsten av AIS markörer. Det är viktigt att bekräfta kulturens kvalitet genom jämförelse med de icke-transfekterade rätterna. Ohälsosamma nervceller tenderar att visa onormal AIS struktur, som avvecklade eller ectopic AIS.För att utvärdera hur en ankyrin-G mänskliga neurodevelopmental störning mutation påverkar AIS montering, den genomsnittliga AIS intensiteten plottades från soma till distala axon. AIS berikade proteiner visar normalt en snabb ökning av signalen från den proximala axonen och en långsam minskning av signalen till den distala axonen. När den är i linje med den icke-transfecterade AIS är mutantkurvan bredare och kurvans topp är lägre, vilket tyder på en strukturförändring av AIS.Den vilda typen ankyrin-G monterad AIS nära i linje med den icke-transfecterade.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection och Primary kultur av embryonala Mouse hippocampus och kortikala Neuroner

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) av fluorescens märkta proteiner i Dendritutskotten hos odlade hippocampus nervceller

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk studie av Axon Regeneration med odlade Vuxna Mjukstrålar neuroner rotganglion

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging pHluorin-märkta receptor Insättning till plasmamembranet i primärt odlade mus Nervceller

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detektering av protein palmitoylering i odlade hippocampus neuroner genom immunprecipitation och Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalciumfosfattransfektion av primär hippocampus nervceller

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Användning av pHluorin för att bedöma dynamiken hos Axon Guidance Receptors i cellkulturen och i kycklingembryon

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging Dendritutskotten av Rat Primär hippocampus nervceller med hjälp av strukturerade Illumination Mikroskopi

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...