Name: modeling hepatitis b virus infection in non-hepatic 293t-ne-3nrs cells
Uploaded: 2020-06-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 81870432 و81570567 إلى X.L.Z.) (رقم 81571994 إلى P.N.S.) وصندوق الأبحاث للعلماء الشباب الدوليين (رقم 81950410640 إلى W.I.)؛ مؤسسة جامعة لي كا شينغ شانتو (رقم 1999-1999). L1111 2008 إلى P.N.S.). نود أن نشكر البروفيسور ستانلي لين من كلية الطب بجامعة شانتو على المشورة المفيدة.

وينبغي إجراء الثقافة، وجمع المواد فوقها من خلايا HepG2.2.15 وعدوى HBV في المستوى الثاني للسلامة الأحيائية (P2) أو السلامة البيولوجية المستوى الثالث (P3) مختبر وفقا لتوجيهات السلامة البيولوجية في البلاد. يجب اتباع ممارسات السلامة المختبرية لضمان سلامة العاملين في المختبرات، وينبغي تطعيم جميع واك?...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+hepatitis+report,+2017.">Global hepatitis report, 2017.</a> World Health Organization. , (2017).</li><li>Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+hepatitis+B+virus+DNA+sequences+in+patients+with+acute+hepatitis+B+infection.">Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection.</a> Hepatology. 12, 187-192 (1990).</li><li>Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+replication+in+diverse+cell+types+during+chronic+hepatitis+B+virus+infection.">Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection.</a> Hepatology. 18, 781-789 (1993).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+is+a+functional+receptor+for+human+hepatitis+B+and+D+virus.">Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.</a> eLife. 1, 00049 (2012).</li><li>Tang, H., McLachlan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+hepatitis+B+virus+by+nuclear+hormone+receptors+is+a+critical+determinant+of+viral+tropism.">Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).</li><li>Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatitis+B+virus+particles+in+Hep+G2+cells+transfected+with+cloned+hepatitis+B+virus+DNA.">Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).</li><li>Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+intermediates+of+hepatitis+B+virus+in+HepG2+cells+that+produce+infectious+virions.">Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions.</a> Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).</li><li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter,+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP).">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+host+factors+support+HBV+infection+in+non-hepatic+293T+cells.">Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells.</a> Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Model+Systems+for+Hepatitis+B+Virus+Research.">In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).</li><li>Liang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B:+the+virus+and+disease.">Hepatitis B: the virus and disease.</a> Hepatology. 49, 13-21 (2009).</li><li>Nie, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+hepatitis+B+virus-host+interactions+in+liver+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).</li><li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+kidney+organoids:+progress+and+remaining+challenges.">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).</li></ol>

هنا، نقدم بروتوكولات لعدوى فيروس التهاب الكبد في خلايا HEPG2-NE غير الكبدية 293T-NE-3NRs والخلايا الكبدية القائمة على الكبد. 293T-NE-3NRs كانت مناسبة لعدوى HBV في كل من GEq عالية ومنخفضة. وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار الخطوات الحاسمة التالية عند استخدام البروتوكول. حالة الخلية هو عامل مهم لنجاح العدوى. يجب تغي...

ويؤثر التهاب الكبد B على حياة أكثر من ملياري شخص، وهو أحد التهديدات الرئيسية للصحة العامة. ما يقرب من 257 مليون شخص مصابين بشكل مزمن بفيروس التهاب الكبد B (HBV) في جميع أنحاء العالم، مما تسبب في عبء كبير على المجتمع1. خلايا الكبد ليست هي الخلايا الوحيدة المصابة بفيروس التهاب الكبد والخلايا الأخرى في الأنسجة غير الكبدية، مثل الكلى والخصيتين، هي أيضا مصابة بهذا الفيروس2،3. حاليا, نماذج خلايا عدوى HBV تقتصر على خلايا الكبد البشرية مع نماذج خط الخلية غير الكبدية فقط. وهذا يعوق دراسة عدوى فيروس التهاب الكبد الوبائي والأمراض المرتبطة بهبسج الكبدي من الأنسجة غير الكبدية. هنا نقدم بروتوكولات لدراسة عدوى HBV في الخلايا 293T غير الكبدية وكذلك في الخلايا التي تعتمد على الكبد.
الصوديوم taurocholate شارك في نقل بوليبيببتيد (NTCP) هو مستقبل وظيفي لالتهاب الكبد البشري B والتهاب الكبد D فيروس4. العامل النووي الكبدي 4α (HNF4α)، مستقبلات ريتينويد X α (RXRα) ومستقبلات التكاثر المنشط البيروكسي (PPARα) هي عوامل النسخ المخصبة بالكبد التي تقيد التروبيزم الفيروسي لـ HBV. وقد تم التحقق منها لتعزيز HBV تخليق الحمض النووي الريبي ودعم النسخ المتماثل HBV في خط الخلية nonhepatoma5. نحن شيدت ثلاثة خطوط الخلايا المختلفة, HepG2 خطوط الخلية التي تعبر عن نتب (HepG2-NE), 293T خط الخلية التعبير عن NTCP (293T-NE) و 293T خط الخلية 293T التعبير عن أربعة الجينات المضيفة; (ب) نظام الـ NTCP، HNF4α، RXRα وPPARα (293T-NE-3NRs). وقد وضعت طريقتين للعدوى HBV على أساس 293T-NE-3NRs (الشكل 1). الأسلوب الأول يستخدم التلقيح في 293T-NE-3NRs مع معادلة عالية من الجينوم الفيروسي (GEq عالية (150)، DMSO وPEG8000) لمدة 24 ساعة. وتستخدم الطريقة الثانية 293T-NE-3NRs مع HepG2.2.15، والتي يمكن أن تنتج جزيئات HBV (GEq منخفضة (حوالي 1.83) دون DMSO و PEG8000)، وبالتالي محاكاة الظروف الطبيعية بشكل وثيق.
وتستمد خلايا HepG2.2.15 من خط HepG2 وإفراز مزمن HBV المعدية، فضلا عن جزيئات تحت فيروسات في وسط الثقافة6،7. السيكلوسبورين A (CsA) هو مناعة تستخدم سريريا لقمع رفض xenograft. وقد أظهرت الدراسات أن CsA يمنع دخول HBV في الكبد المستزرعة عن طريق تثبيط نشاط الناقل من NTCP ومنع ربط نتاب لبروتينات المغلف كبيرة8.
استخدمت خلايا HEPG2-NE كتحكم إيجابي في حين تم استخدام الخلايا المعالجة CsA كتحكم سلبي. من خلال المقارنة مع مجموعات التحكم الإيجابية والسلبية ، يمكننا معرفة الجينات المضيفة التي تلعب دورًا حاسمًا في عدوى فيروس التهاب الكبد B. بالإضافة إلى ذلك، من خلال هذا الوضع من عدوى فيروس التهاب الكبد B، يمكننا أيضا العثور على آليات جديدة أخرى أو الجينات المضيفة المشاركة في عدوى فيروس التهاب الكبد B.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45&#956;m membrane filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RB</td>
			<td>Filter for HepG 2.2.15 supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T-NE</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T-NE-3NRs</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>594 labeled goat against rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For immunofluorescence assay,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP010006</td>
			<td>For co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td>For concentration of HepG 2.2.15 supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023</td>
			<td>For immunofluorescence assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin A</td>
			<td>Sangon biotech</td>
			<td>59865-13-3</td>
			<td>inhibitor of HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)</td>
			<td>DAAN GENE</td>
			<td>7265-2013</td>
			<td>For HBV DNA detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClong</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For improvement of infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#65288;FBS&#65289;</td>
			<td>CLARK Bioscience</td>
			<td>FB25015</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio observer Z1</td>
			<td>For immunofluorescence assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2-NE</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBcAg antibody</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZA-0121</td>
			<td>For immunofluorescence assay, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td>For cell wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P8260</td>
			<td>For infection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3412</td>
			<td>For co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Douban</td>
			<td>6971728840012</td>
			<td>Viruside</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling hepatitis b virus infection in non-hepatic 293t-ne-3nrs cells

HBV يصيب أساسا الكبدات البشرية، ولكن تم أيضا العثور على أن تصيب الأنسجة خارج الكبد مثل الكلى والخصية. ومع ذلك، تقتصر نماذج HBV القائمة على الخلايا على خطوط خلايا الكبد (مثل HepG2 و Huh7) بشكل مفرط في مستقبلات HBV الوظيفية، توروشولاتي الصوديوم شارك في نقل بوليبيبتيد (NTCP). هنا، استخدمنا 293T-NE-3NRs (293T OVEREXP الإنسان، HNF4α، RXRα وPPARα) وHpG2-NE (HEpG2 OVEREXPRESSING) كطريف الخلايا النموذجية.   وقد أجريت العدوى بفيروس التهاب الكبد B في هذه الخطوط الخلوية إما باستخدام جزيئات فيروس HBV المركزة من HepG2.2.15 أو شارك في زراعة HepG2.2.15 مع خطوط الخلايا المستهدفة. تم إجراء الفلور المناعية HBcAg لHBcAg لتأكيد عدوى HBV. الطريقتان المقدمتان هنا ستساعدنا على دراسة عدوى فيروس التهاب الكبد في خطوط الخلايا غير الكبدية.

نحن شيدت pSIN-NTCP-EGFP plasmid التعبير عن نتب وEGFP الانصهار ومع مقاومة البوروميسين. تم نقل البلازميد إلى خلايا HepG2 و 293T لبناء خطوط الخلايا المستقرة HepG2-NE و 293T-NE التعبير عن NTCP و EGFP. تم نقل Plasmids (pSIN-HNF4α، pSIN-RXRα، pLV-PPARα-بورو-العلم) مع مقاومة البوروميسين والتعبير إلى خلايا 293T-NE لبناء خط خلية مستقر يعبر عن 4 الج...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells at JoVE.com

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلاً لعدوى فيروس التهاب الكبد B (HBV) في الخلايا 293T الجديدة المهندسة (293T-NE-3NRs، التي تعبر عن بروتP الإنسان، HNF4α، RXRα وPPARα) والخلايا الكبدية التقليدية (HepG2-NE، التعبير عن الـ NTCP البشري).

النمذجة التهاب الكبد الوبائي باء العدوى بفيروس في الخلايا غير الكبدية 293T-NE-3NRs

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

HBV الفيروسية في التكاثر خارج الكبد يلعب دورا هاما في التسبب في المتلازمات خارج الكبد. حاليا، نماذج ثقافة الخلية لبدء عدوى HBV خارج الكبد محدودة. نقدم نموذج عدوى غير الكبدية في المختبر للمساعدة في تحديد عوامل المضيف الجديدة التي تؤثر على تكرار HBV والتحقيق في أمراض الكلى المرتبطة HBV.بالمقارنة مع نماذج العدوى HBV التقليدية، اعتمدنا وهندسنا 293T خط الخلية، 293T-NE-3NR، وشارك في استزراعه مع HepG2.2.15. وينبغي أن يتم تنفيذ العدوى بفيروس التهاب الكبد B في مستوى السلامة الأحيائية الثاني أو في مختبر السلامة الأحيائية الثالث. يجب اتباع ممارسات السلامة المختبرية لضمان سلامة العاملين في المختبرات وينبغي تطعيم جميع الباحثين والكشف عن الأجسام المضادة HBS إيجابية قبل إجراء تجارب HBV.تبدأ من خلال زراعة خلايا HepG2.2.15 مع الأخذ في الاعتبار أن الخلية supernatant وكذلك جميع النصائح، وقارين، لوحات، والأنابيب التي تأتي في اتصال مع HepG2.2.15 ينبغي أن تكون غارقة في 2٪ virucide بين عشية وضحاها قبل التخلص منها. إزالة القارورة التي تحتوي على خلايا HepG2.2.15 من النيتروجين السائل وذوبان في دوامة لطيف في حمام الماء 37 درجة مئوية. نقل الخلايا إلى قارورة زراعة الأنسجة مربعة 25 سنتيمتراً وإضافة أربعة ملليلترات من متوسط الثقافة الكامل.ثقافة الخلايا HepG2.2.15 في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة. تغيير الوسط كل ثلاثة أيام. عندما تكون جاهزة، وجمع عظمى الخلية في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر.أغلق الغطاء بحزم ولفه بـ فيلم البارافين. لإزالة شظايا الخلية، قم بتصفية جهاز HepG2.2.15 مع غشاء ميكرومتر 0.45 في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 ملليلتر. ثم إضافة 14 ملليلتر من عظمى تمت تصفيتها إلى عمود مركز الفيروسات وإغلاق الغطاء.الطرد المركزي العمود في 3، 200 مرة ز لمدة 35 دقيقة في جهاز طرد مركزي الغزل الأفقي وجمع التركيز 2.2.2.15 فوق في أنبوب 1.5 ملليلتر. تشغيل PCR في الوقت الحقيقي للتأكد من أن التركيز إذا كان الحمض النووي HBV في التركيز فوق 2.2.15 هو في نطاق منحنى القياسية. تخفيف التركيز 20-fold بإضافة 10 ميكرولترات إلى 190 ميكرولترات من DMEM في أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر.جنبا إلى جنب مع التركيز فوق، وإعداد سيطرة سلبية، والسيطرة الإيجابية، وأربعة تخفيف من المرجع الكمي. إضافة 450 ميكرولترات من HBV DNA استخراج العازلة لكل عينة والطرد المركزي لهم في 12،000 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. الجمع بين 27 ميكرولترات من مزيج رئيسي PCR وثلاثة microliters من انزيم طق polymerase لكل عينة في أنابيب PCR وضعت على الجليد.ثم إضافة 20 ميكرولترات من عينة الطرد المركزي إلى كل أنبوب. تنفيذ PCR في الوقت الحقيقي وفقا لتوجيهات المخطوطات وتصدير قيم CT للحصول على منحنى قياسي. قسم التركيز فوق 2.2.15 اعلي اقسط وتخزينه في ناقص 80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.إعداد عدوى المتوسطة وفقا لاتجاهات المخطوطات. ثم البذور HepG2-NE في اثنين من الآبار، 293T-NE-3NR الخلايا في بئرين، و 293T-NE في بئر واحد. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة لمدة 24 ساعة.بعد الحضانة، لاحظ الخلايا والمضي قدما مع العدوى إذا كانت صحية. إضافة 500 ميكرولترات من مجمع العدوى إلى كل بئر واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. غسل الخلايا مرتين مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.ثم يضاف ملليلتر واحد من متوسطة لكل بئر. تغيير المتوسطة بلطف كل يومين. في اليوم 11 ، يغسل الخلايا برفق مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع الميثانول البارد المثلج للفلوروس المناعي.البذور 100، 000 خلية في بئر من HepG-NE في بئرين، 293T-NE-3NRs في بئرين، و 293T-NE في بئر واحد من لوحة. البذور 100، 000 خلية في بئر من HepG2.2.15 في خمسة إدراج الغشاء في لوحة منفصلة ستة-جيدا. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة.بعد الحضانة، تأكد من أن الخلايا كلها منتَكِدة وفي حالة جيدة. تجاهل المتوسطة في لوحة ستة بئر وإدراج غشاء الخلية. ثم ضع الغشاء مع إدراج HepG2.2.15 في لوحة ستة جيدا بذر مع HEPG-NE، 293T-NE-3NRs، و 293T-NE.احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة، وتغيير المتوسطة كل ثلاثة إلى أربعة أيام. بعد 10 أيام، وإزالة إدراج الغشاء، وغسل بلطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين، وإصلاح الخلايا مع الميثانول الباردة المثلج للflufluorescence. وقد أدى الاحتضان مع الأجسام المضادة الأساسية HBcAg وDAPI إلى تلطيخ متميز عند ملاحظته بهدف 10X على مجهر مقلوب فلوري.تم تأكيد التوطين النووي من خلال التلطيخ مع DAPI وتم تحديد تعبير NTCP-EGFP مع الفلورس الخضراء. مواقع التعبير من HBcAg كانت موجودة مع الفلورس الأحمر. عندما DAPI و NTCP وHBcAg في نفس الخلية، الخلية قد تم بنجاح مع فيروس التهاب الكبد.وكانت مجموعة السيكلوسبورين A هي السيطرة السلبية لأنها تمنع HBV من دخول الخلايا عن طريق منع نتروب. تم الكشف عن HBcAg في 293T-NE-3NRs، ولكن ليس في خلايا 293T-NE تشير إلى أن NTCP ليس العامل الوحيد الضروري لعدوى HBV في 293T. حالة الخلية جيدة وكفاءة العملية هي النقاط الرئيسية للحصول على نتائج ناجحة العدوى.غسل لطيف وتغيير وسائل الإعلام بعد العدوى مهم أيضا. كبديل, التهاب الكبد الوبائي طريقة مع خلايا HepG2-NE القائم على الورم الكبدي لديه أعلى كفاءة العدوى من هذه الطريقة ومناسبة لفحص المخدرات المضادة HBV. النمذجة عدوى HBV في 293T-NE-3NR هو مجاملة مفيدة لنموذج الخلية التقليدية بسبب خلفية غير الكبدي لهذه الخلايا.هذه الطريقة سوف تسهل دراسة عدوى فيروس التهاب الكبد في الخلايا غير الكبدية، فضلا عن العوامل المضيفة اللازمة للكبد من فيروس التهاب الكبد.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

فحوص للكشف عن العوامل رني المضيفة المعنية في الوقس عدوى فيروس باستخدام ذبابة الفاكهة خلايا

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

المؤتلف إنتاج فيروسات الرجعية والعدوى من خلايا B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

بروتوكول لتحليل التهاب الكبد الوبائي فيروس النسخ المتماثل

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

نماذج دورة حياة فيروس الايبولا تحت شروط السلامة الأحيائية المستوى 2 مع جزيئات تشبه الفيروسات يحتوي على Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

الكشف عن نسخة منخفضة العدد الحمض النووي الفيروسي المتكاملة التي شكلتها في المختبر عدوى التهاب الكبد باء

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

الثقافات "الكبد على رقاقة" خلايا الكبد الأولية وخلايا كوبفر للعدوى بفيروس التهاب الكبد B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...