Name: modeling hepatitis b virus infection in non-hepatic 293t-ne-3nrs cells
Uploaded: 2020-06-05T14:30:00
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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 und 81570567 bis X.L.Z.), (Nr. 81571994 bis P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (Nr. 81950410640 bis W.I.) unterstützt. Die Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 bis P.N.S.). Wir danken Prof. Stanley Lin vom Shantou University Medical College für ihre sachdienliche Beratung.

Kultur, Sammlung von Überstandstoffen aus HepG2.2.15-Zellen und HBV-Infektion sollte in Biosicherheits-Level II (P2) oder Biosicherheits-Level III (P3) Labor nach der Biosicherheits-Anleitung im Land durchgeführt werden. Die Sicherheitspraktiken im Labor sollten befolgt werden, um die Sicherheit des Laborpersonals zu gewährleisten, und alle sollten geimpft und HBsAb-positiv nachgewiesen werden, bevor HBV-Experimente durchgeführt werden. Beobachten Sie den Zustand der Zellen bei jedem Schritt, bevor Sie mit dem nächs...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+hepatitis+report,+2017.">Global hepatitis report, 2017.</a> World Health Organization. , (2017).</li><li>Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+hepatitis+B+virus+DNA+sequences+in+patients+with+acute+hepatitis+B+infection.">Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection.</a> Hepatology. 12, 187-192 (1990).</li><li>Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+replication+in+diverse+cell+types+during+chronic+hepatitis+B+virus+infection.">Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection.</a> Hepatology. 18, 781-789 (1993).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+is+a+functional+receptor+for+human+hepatitis+B+and+D+virus.">Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.</a> eLife. 1, 00049 (2012).</li><li>Tang, H., McLachlan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+hepatitis+B+virus+by+nuclear+hormone+receptors+is+a+critical+determinant+of+viral+tropism.">Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).</li><li>Sells, M. 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Z., Shvartsman, M., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+intermediates+of+hepatitis+B+virus+in+HepG2+cells+that+produce+infectious+virions.">Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions.</a> Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).</li><li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter,+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP).">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+host+factors+support+HBV+infection+in+non-hepatic+293T+cells.">Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells.</a> Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Model+Systems+for+Hepatitis+B+Virus+Research.">In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).</li><li>Liang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B:+the+virus+and+disease.">Hepatitis B: the virus and disease.</a> Hepatology. 49, 13-21 (2009).</li><li>Nie, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+hepatitis+B+virus-host+interactions+in+liver+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).</li><li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+kidney+organoids:+progress+and+remaining+challenges.">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).</li></ol>

Hier führen wir Protokolle für HBV-Infektionen in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs und Hepatom-basierten HepG2-NE-Zellen ein. 293T-NE-3NRs waren sowohl bei hohen als auch niedrigen GEq-Infektionen für HBV-Infektionen geeignet. Bei der Verwendung unseres Protokolls müssen die folgenden kritischen Schritte berücksichtigt werden. Der Zellstatus ist ein wichtiger Faktor für eine erfolgreiche Infektion. Das Infektionsmedium muss rechtzeitig nach der Anfangsperiode der HBV-Infektion gewechselt werden. 293T-NE-3NRs-Zellen s...

Hepatitis B betrifft das Leben von mehr als 2 Milliarden Menschen und ist eine der größten Bedrohungen für die öffentliche Gesundheit. Weltweit sind rund 257 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) infiziert, was dieGesellschaftschwer belastet 1 . Hepatozyten sind nicht die einzigen Zellen, die von HBV und anderen Zellen in nicht-hepatischem Gewebe infiziert sind, wie Niere und Hoden, sind auch mit diesem Virus infiziert2,3. Derzeit sind HBV-Infektionszellmodelle auf menschliche Hepatozyten mit nur wenigen nicht-hepatischen Zelllinienmodellen beschränkt. Dies behindert die Untersuchung der HBV-Infektion und der HBV-bedingten Pathologie von nicht-hepatischen Geweben. Hier stellen wir Protokolle zur Untersuchung der HBV-Infektion in nicht-hepatischen 293T-Zellen sowie in Häpatom-basierten Zellen vor.
Natriumtaurocholat Co-Transporting Polypeptid (NTCP) ist ein funktioneller Rezeptor für menschliche Hepatitis B und Hepatitis D Virus4. Hepatozyten-Kernfaktor 4 (HNF4), Retinoid-X-Rezeptor (RXR) und Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR) sind leberangereicherte Transkriptionsfaktoren, die den viralen Tropismus von HBV einschränken. Sie wurden verifiziert, um die vorgenomische RNA-Synthese der HBV zu fördern und die HBV-Replikation in einer Nichthäpatom-Zelllinie5zu unterstützen. Wir konstruierten drei verschiedene Zelllinien, HepG2-Zelllinien, die NTCP (HepG2-NE), 293T-Zelllinie exzätsierend NTCP (293T-NE) und 293T Zelllinie, die vier Wirtsgene exizieren; NTCP, HNF4, RXR und PPAR (293T-NE-3NRs). Auf der Grundlage von 293T-NE-3NRs wurden zwei Methoden zur HBV-Infektion entwickelt (Abbildung 1). Die erste Methode verwendet die Impfung in 293T-NE-3NRs mit hoher viraler Genomäquivalenz (hohe GEq (150), DMSO und PEG8000) für 24 h. Die zweite Methode verwendet co-culturing 293T-NE-3NRs mit HepG2.2.15, die HBV-Partikel (niedrige GEq (ca. 1,83) ohne DMSO und PEG8000 produzieren können, wodurch die natürlichen Bedingungen eng nachgeahmt werden.
HepG2.2.15-Zellen werden aus der HepG2-Linie abgeleitet und seiteln chronisch infektiöse HBV sowie subvirale Partikel in das Kulturmedium6,7. Cyclosporin A (CsA) ist ein Immunsuppressivum, das klinisch zur Unterdrückung der Xenograft-Abstoßung verwendet wird. Studien haben gezeigt, dass CsA den HBV-Eintrag in kultivierte Hepatozyten hemmt, indem es die Transporteraktivität von NTCP hemmt und die Bindung von NTCP an große Hüllproteine blockiert8.
HepG2-NE-Zellen wurden als Positivkontrolle verwendet, während CsA-behandelte Zellen als Negativkontrolle verwendet wurden. Im Vergleich zu den positiven und negativen Kontrollgruppen können wir herausfinden, welche Wirtsgene bei der HBV-Infektion eine entscheidende Rolle spielen. Darüber hinaus können wir durch diese Art der HBV-Infektion auch andere neuartige Mechanismen oder Wirtsgene finden, die an einer HBV-Infektion beteiligt sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45&#956;m membrane filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RB</td>
			<td>Filter for HepG 2.2.15 supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T-NE</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T-NE-3NRs</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>594 labeled goat against rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For immunofluorescence assay,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP010006</td>
			<td>For co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td>For concentration of HepG 2.2.15 supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023</td>
			<td>For immunofluorescence assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin A</td>
			<td>Sangon biotech</td>
			<td>59865-13-3</td>
			<td>inhibitor of HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)</td>
			<td>DAAN GENE</td>
			<td>7265-2013</td>
			<td>For HBV DNA detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClong</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For improvement of infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#65288;FBS&#65289;</td>
			<td>CLARK Bioscience</td>
			<td>FB25015</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio observer Z1</td>
			<td>For immunofluorescence assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2-NE</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBcAg antibody</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZA-0121</td>
			<td>For immunofluorescence assay, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td>For cell wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P8260</td>
			<td>For infection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3412</td>
			<td>For co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Douban</td>
			<td>6971728840012</td>
			<td>Viruside</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling hepatitis b virus infection in non-hepatic 293t-ne-3nrs cells

HBV infiziert hauptsächlich menschliche Hepatozyten, aber es wurde auch gefunden, um extrahepatische Gewebe wie Niere und Hoden zu infizieren. Dennoch sind zellbasierte HBV-Modelle auf Hepatom-Zelllinien (wie HepG2 und Huh7) beschränkt, die einen funktionellen HBV-Rezeptor, Natrium-Taurochoat-Co-Transport-Polypeptid (NTCP), überausdrücken. Hier verwendeten wir 293T-NE-3NRs (293T überexpressing human NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) als Modellzellenlinien.   Die HBV-Infektion in diesen Zelllinien wurde entweder unter Verwendung konzentrierter HBV-Viruspartikel aus HepG2.2.15 oder durch kokultivierende HepG2.2.15 mit den Zielzelllinien durchgeführt. HBcAg Immunfluoreszenz für HBcAg wurde durchgeführt, um HBV-Infektion zu bestätigen. Die beiden hier vorgestellten Methoden werden uns helfen, HBV-Infektionen in nicht-hepatischen Zelllinien zu untersuchen.

Wir konstruierten pSIN-NTCP-EGFP Plasmid, das NTCP und EGFP Fusion und mit Puromycin-Resistenz ausdrückt. Das Plasmid wurde in HepG2- und 293T-Zellen transfiziert, um stabile Zelllinien HepG2-NE und 293T-NE zu konstruieren, die NTCP und EGFP exzättieren. Plasmide (pSIN-HNF4, pSIN-RXR, pLV-PPAR-puro-flag) mit Puromycinresistenz und Expression wurden in 293T-NE-Zellen transfiziert, um eine stabile Zelllinie zu konstruieren, die 4 Wirtsgene9exektiert. Die Expression von NTCP-EGFP kann durch grüne ...

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Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Hepatitis-B-Virus-Infektion (HBV) in neuartigen 293T-Zellen (293T-NE-3NRs, die menschliche NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und traditionelle Leberzellen (HepG2-NE, exzessizierenden menschlichen NTCP) exdrücken.

Modellierung der Hepatitis-B-Virusinfektion in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs-Zellen

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

Die HBV-Virusreplikation bei der Extrahepatie spielt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von extrahepatischen Syndromen. Derzeit sind Zellkulturmodelle für den Beginn einer extrahepatischen HBV-Infektion begrenzt. Wir präsentieren ein in vitro nicht-hepatisches Infektionsmodell, um neuartige Wirtsfaktoren zu identifizieren, die die HBV-Replikation beeinflussen, und HBV-bedingte Nierenerkrankungen zu untersuchen.Im Vergleich zu herkömmlichen HBV-Infektionsmodellen haben wir 293T-Zelllinie, 293T-NE-3NR, übernommen und entwickelt und mit HepG2.2.15 kokultiviert. HBV-Infektion sollte in einem Labor der Biosicherheitsstufe zwei oder der Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt werden. Die Sicherheitspraktiken im Labor sollten befolgt werden, um die Sicherheit des Laborpersonals zu gewährleisten, und alle Forscher sollten geimpft werden und HBS-Antikörper positiv erkennen, bevor hBV-Experimente durchgeführt werden.Beginnen Sie mit der Kultivierung der HepG2.2.15-Zellen unter Berücksichtigung, dass die Zellüberstand sowie alle Spitzen, Kolben, Platten und Röhren, die in Kontakt mit HepG2.2.15 kommen, sollten in 2%Virucide über Nacht vor der Entsorgung eingeweicht werden. Entfernen Sie die Durchstechflasche mit HepG2.2.15-Zellen aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie in einem 37 Grad Celsius Wasserbad auf. Übertragen Sie die Zellen auf einen 25 Zentimeter großen quadratischen Gewebekulturkolben und fügen Sie vier Milliliter komplettes Kulturmedium hinzu.Kultur die HepG2.2.15 Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator. Ändern Sie das Medium alle drei Tage. Wenn Sie bereit sind, sammeln Sie den Zellüberstand in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr.Schließen Sie den Deckel fest und wickeln Sie ihn mit Paraffinfolie. Um die Zellfragmente zu entfernen, filtern Sie den HepG2.2.15 Überstand mit einer 0,45 Mikrometer Membran in ein neues 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Dann 14 Milliliter gefilterten Überstand zu einer Viruskonzentratorspalte hinzufügen und den Deckel schließen.Zentrifugieren Sie die Säule 3,200 mal g für 35 Minuten in einer horizontalen Spinnzentrifuge und sammeln Sie das HepG2.2.15 Überstandkonzentrat in ein 1,5-Milliliter-Rohr. Führen Sie Echtzeit-PCR aus, um sicherzustellen, dass die Konzentration, wenn die HBV-DNA im HepG2.2.15 Überstandkonzentrat innerhalb des Standardkurvenbereichs liegt. Verdünnen Sie das Konzentrat 20-fach, indem Sie 10 Mikroliter zu 190 Mikroliter DMEM in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr hinzufügen.Zusammen mit dem Überstandkonzentrat eine Negative Kontrolle, eine positive Kontrolle und vier Verdünnungen der quantitativen Referenz vorbereiten. Fügen Sie 450 Mikroliter HBV-DNA-Extraktionspuffer zu jeder Probe hinzu und zentrifugieren Sie sie bei 12.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Kombinieren Sie 27 Mikroliter PCR-Master-Mix und drei Mikroliter Taq-Polymerase-Enzym pro Probe in PCR-Röhren, die auf Eis gelegt werden.Dann fügen Sie 20 Mikroliter der zentrifugierten Probe zu jedem Rohr hinzu. Führen Sie Echtzeit-PCR nach Manuskriptrichtungen aus und exportieren Sie die CT-Werte, um eine Standardkurve zu erhalten. Das HepG2.2.15 Überstandkonzentrat in Aliquots aufteilen und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis es einsatzbereit ist.Bereiten Sie Infektionsmedium nach Manuskript Richtungen. Dann Säen HepG2-NE in zwei Brunnen, 293T-NE-3NR-Zellen in zwei Brunnen, und 293T-NE in einem Brunnen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator für 24 Stunden.Nach der Inkubation beobachten Sie die Zellen und gehen Sie mit der Infektion fort, wenn sie gesund sind. Fügen Sie 500 Mikroliter des Infektionskomplexes zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 Mikroliter PBS.Dann fügen Sie einen Milliliter Medium zu jedem Brunnen. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage sanft. Waschen Sie die Zellen an Tag 11 vorsichtig zweimal mit 500 MikroliterPBS und fixieren Sie die Zellen mit eiskaltem Methanol zur Immunfluoreszenz.Samen 100. 000 Zellen pro Bohrkörper von HepG-NE in zwei Brunnen, 293T-NE-3NRs in zwei Bohrungen und 293T-NE in einem Brunnen der Platte. Samen 100.000 Zellen pro Bohrkörper von HepG2.2.15 in fünf Membraneinsätze in einer separaten Sechs-Brunnen-Platte. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden.Stellen Sie nach der Inkubation sicher, dass die Zellen alle haftbar und in gutem Zustand sind. Entsorgen Sie das Medium in der Sechs-Brunnen-Platte und die Zellmembraneinsätze. Dann legen Sie die Membraneinsätze mit HepG2.2.15 in die mit HepG-NE, 293T-NE-3NRs und 293T-NE gesäte Sechs-Well-Platte.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator, wodurch sich das Medium alle drei bis vier Tage ändert. Nach 10 Tagen die Membraneinsätze entfernen, die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS waschen und die Zellen mit eiskaltem Methanol zur Immunfluoreszenz fixieren. Die Inkubation mit dem primären HBcAg-Antikörper und DAPI führte zu einer deutlichen Färbung, wenn sie mit einem 10-fachen Objektiv auf einem fluoreszierenden invertierten Mikroskop beobachtet wurde.Die kerntechnische Lokalisierung wurde durch Färbung mit DAPI bestätigt und die NTCP-EGFP-Expression wurde mit grüner Fluoreszenz identifiziert. Die Expressionsstellen von HBcAg befanden sich mit roter Fluoreszenz. Wenn sich DAPI, NTCP und HBcAg in derselben Zelle befinden, wurde die Zelle erfolgreich mit HBV infiziert.Die Cyclosporin-A-Gruppe war die negative Kontrolle, da sie verhindert, dass HBV durch Blockieren von NTCP in Zellen eindringt. HBcAg wurde in 293T-NE-3NRs nachgewiesen, aber nicht in 293T-NE-Zellen, was darauf hinweist, dass NTCP nicht der einzige faktor ist, der für eine HBV-Infektion bei 293T unerlässlich ist. Ein guter Zellstatus und ein effizienter Betrieb sind die Schlüsselpunkte für erfolgreiche Infektionsergebnisse.Auch das sanfte Waschen und Medienwechsel nach der Infektion ist wichtig. Als Alternative, HBV-Infektionsmethode mit Hepatoma-basierten HepG2-NE-Zellen hat eine höhere Infektionseffizienz als diese Methode und eignet sich für Anti-HBV-Arzneimittel-Screening. Die Modellierung einer HBV-Infektion in 293T-NE-3NR ist aufgrund des nicht-hepatischen Hintergrunds dieser Zellen ein nützliches Kompliment für das traditionelle Zellmodell.Diese Methode wird die Untersuchung der HBV-Infektion in nicht-hepatischen Zellen sowie Wirtsfaktoren für die Leber von HBV erforderlich erleichtern.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modellierung des Lebenszyklus von Ebola Virus unter Biosafety Level 2 Bedingungen mit Virus-ähnlichen Partikeln, die Tetracistronic Minigenome

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Erkennung von niedrigen Kopie Nummer integrierte virale DNA gebildet durch In-vitro- Hepatitis B-Infektion

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...