Name: modeling hepatitis b virus infection in non-hepatic 293t-ne-3nrs cells
Uploaded: 2020-06-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 81870432 ו 81570567 X.L.Z.), (No. 81571994 כדי P.N.S.), קרן מחקר למדענים צעירים בינלאומיים (No. 81950410640 ל-W.I.); הקרן האוניברסיטאי לShantou לי קה (לא. L1111 2008 לP.N.S.). ברצוני להודות לפרופ ' סטנלי לין מהמכללה לרפואה של אוניברסיטת Shantou לקבלת עצות שימושיות.

תרבות, אוסף של סופרנטנים מן התאים hepg 2.2.15 ו הזיהום hbv יש לבצע ברמת בטיחות II (P2) או ביולוגי רמת בטיחות III (P3) המעבדה על פי ההדרכה אבטחה טיחות בארץ. שיטות בטיחות מעבדה צריך להיות בעקבות כדי להבטיח את הבטיחות של אנשי המעבדה, וכל צריך להיות חוסנו וזיהה HBsAb חיובי לפני ביצוע ניסויים HBV. התבונן במצב התאי...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+hepatitis+report,+2017.">Global hepatitis report, 2017.</a> World Health Organization. , (2017).</li><li>Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+hepatitis+B+virus+DNA+sequences+in+patients+with+acute+hepatitis+B+infection.">Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection.</a> Hepatology. 12, 187-192 (1990).</li><li>Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+replication+in+diverse+cell+types+during+chronic+hepatitis+B+virus+infection.">Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection.</a> Hepatology. 18, 781-789 (1993).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+is+a+functional+receptor+for+human+hepatitis+B+and+D+virus.">Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.</a> eLife. 1, 00049 (2012).</li><li>Tang, H., McLachlan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+hepatitis+B+virus+by+nuclear+hormone+receptors+is+a+critical+determinant+of+viral+tropism.">Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).</li><li>Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatitis+B+virus+particles+in+Hep+G2+cells+transfected+with+cloned+hepatitis+B+virus+DNA.">Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).</li><li>Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+intermediates+of+hepatitis+B+virus+in+HepG2+cells+that+produce+infectious+virions.">Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions.</a> Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).</li><li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter,+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP).">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+host+factors+support+HBV+infection+in+non-hepatic+293T+cells.">Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells.</a> Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Model+Systems+for+Hepatitis+B+Virus+Research.">In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).</li><li>Liang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B:+the+virus+and+disease.">Hepatitis B: the virus and disease.</a> Hepatology. 49, 13-21 (2009).</li><li>Nie, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+hepatitis+B+virus-host+interactions+in+liver+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).</li><li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+kidney+organoids:+progress+and+remaining+challenges.">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).</li></ol>

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור זיהום HBV בתוך 293T-NE-3NRs-מבוססי hepatoma תאים HepG2-NE. 293T-NE-3NRs היו מתאימים לזיהום HBV בשני גבוה ונמוך GEq. יש לקחת בחשבון את הצעדים הקריטיים הבאים תוך שימוש בפרוטוקול שלנו. מצב התא הוא גורם חשוב להידבקות מוצלחת. בינוני זיהום חייב להשתנות בזמן לאחר התקופה הראשונית של זיהום HB...

צהבת B משפיע על חייהם של יותר מ-2,000,000,000 אנשים והוא אחד האיומים העיקריים לבריאות הציבור. כ 257,000,000 אנשים נגועים באופן כרוני עם צהבת B וירוס (HBV) ברחבי העולם, גרימת נטל גדול לחברה1. Hepatocytes הם לא התאים היחידים הנגועים על ידי hbv ותאים אחרים ברקמה שאינה הכבד, כגון כליות ובנות, הם נגועים גם על ידי וירוס זה2,3. כיום, מודלים תא הזיהום HBV מוגבלים האדם hepatocytes עם רק כמה מודלים שאינם הכבד קו התא. זה הסלים המחקר של זיהום HBV ו-HBV הקשורות הפתולוגיה של רקמות לא הכבד. כאן אנו מציגים פרוטוקולים כדי ללמוד זיהום HBV בתאי 293T שאינם הכבד, כמו גם בתאים hepatoma מבוססי.
סודיום טאורוכולאט שיתוף פוליפטידים (ntcp) הוא קולטן תפקודית עבור צהבת האדם B ו הפטיטיס D וירוס4. Hepatocyte גורם גרעיני 4α (HNF4α), קולטן X retinoid α (rxrα) ו פראוקסיזום המופעל מפיצים מופעל α (pparα) הם הכבד מועשר שעתוק גורמים הגבלת tropism ויראלי של hbv. הם אומתו לקדם את הסינתזה של HBV RNA ותמיכה ב-HBV בשכפול התאיםבתוךקו שאינו תא 5. בנינו שלושה קווי תא שונים, HepG2 התאים קווי המבטא NTCP (HepG2-NE), 293T התא t המבטא NTCP (293T-NE) ו 293T התא t להביע ארבעה גנים מארחים; NTCP, HNF4α, RXRα ו PPARα (293T-NE-3NRs). שתי שיטות לזיהום HBV פותחו על בסיס 293T-NE-3NRs (איור 1). השיטה הראשונה משתמשת בחיסונים ב-293T-NE-3NRs עם שקילות הגנום ויראלי גבוהה (GEq גבוה (150), DMSO ו PEG8000) עבור 24 h. השיטה השנייה מעסיקה co-culturing 293T-NE-3NRs עם HepG 2.2.15, אשר יכול לייצר חלקיקי HBV (GEq נמוך (על 1.83) ללא DMSO ו PEG8000), ובכך היטב מחקות את התנאים הטבעיים.
התאים hepg 2.2.15 נגזרים מהקו HepG2 ובאופן כרוני מפרישות hbv זיהומיות, כמו גם חלקיקים תת ויראלי לתוך מדיום התרבות6,7. ציקלוספורין A (CsA) הוא מדכא חיסוני קליני המשמש לדיכוי דחייה של השתל. מחקרים הראו כי CsA מעכב את כניסת HBV לתוך החלציטים תרבותית על ידי עיכוב פעילות הטרנספורטר של NTCP וחסימת האיגוד של NTCP כדי חלבונים מעטפה גדולה8.
HepG2-NE תאים שימשו שליטה חיובית ואילו תאים שטופלו CsA שימשו שליטה שלילית. על ידי השוואת עם קבוצות שליטה חיוביות ושליליות, אנחנו יכולים לגלות אילו גנים מארחים לשחק תפקיד קריטי בזיהום HBV. בנוסף, באמצעות מצב זה של זיהום HBV, אנחנו יכולים גם למצוא מנגנונים חדשניים אחרים או גנים מארחים המעורבים בזיהום HBV.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45&#956;m membrane filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RB</td>
			<td>Filter for HepG 2.2.15 supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T-NE</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T-NE-3NRs</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>594 labeled goat against rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For immunofluorescence assay,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP010006</td>
			<td>For co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td>For concentration of HepG 2.2.15 supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023</td>
			<td>For immunofluorescence assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin A</td>
			<td>Sangon biotech</td>
			<td>59865-13-3</td>
			<td>inhibitor of HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)</td>
			<td>DAAN GENE</td>
			<td>7265-2013</td>
			<td>For HBV DNA detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClong</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For improvement of infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#65288;FBS&#65289;</td>
			<td>CLARK Bioscience</td>
			<td>FB25015</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio observer Z1</td>
			<td>For immunofluorescence assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2-NE</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBcAg antibody</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZA-0121</td>
			<td>For immunofluorescence assay, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td>For cell wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P8260</td>
			<td>For infection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3412</td>
			<td>For co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Douban</td>
			<td>6971728840012</td>
			<td>Viruside</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling hepatitis b virus infection in non-hepatic 293t-ne-3nrs cells

HBV מדביק בעיקר את הפטוציטים האנושית, אבל זה גם נמצא להדביק רקמות חוץ הכבד כגון כליות ובנות. עם זאת, מודלים מבוססי תא hbv מוגבלים לקווי התאים של hepatoma (כגון HepG2 ו Huh7) על-ידי הבעת קולטן hbv תפקודית, סודיום טאורוכולאט הובלת פוליפטידים (ntcp). כאן, השתמשנו 293T-NE-3NRs (293T ביטוי יתר של האדם NTCP, HNF4α, RXRα ו PPARα) ו HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) כמו קווי תא דגם.   הידבקות HBV בקווי תאים אלה בוצעה גם באמצעות חלקיקי וירוס HBV מרוכזים מ-HepG 2.2.15 או co-culturing HepG 2.2.15 עם קווי תא היעד. בוצעה כדי לאשר. זיהום של HBV שתי השיטות המוצגות כאן תסייע לנו ללמוד זיהום HBV בקווים שאינם תאי הכבד.

בנינו pSIN-NTCP-EGFP ביטוי במבטא NTCP ו EGFP היתוך עם puromycin התנגדות. הפלבאמצע היה מנוכר לתוך HepG2 ו 293T תאים לבניית קווי תאים יציבים HepG2-NE 293T-NE ביטוי NTCP ו EGFP. פלמידים (pSIN-HNF4α, pSIN-Rxra, pLV-PPARα-puro-דגל) עם puromycin התנגדות וביטוי היו מזוהמים לתוך 293T-NE תאים לבניית קו תא יציב המבטא 4 גנים מארחים9. הביטוי של NTCP...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells at JoVE.com

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור הפטיטיס B וירוס (HBV) זיהום בתאי 293T מהונדסים הרומן (293T-NE-3NRs, הבעת NTCP אנושי, HNF4α, RXRα ו PPARα) ותאי הכבד המסורתית (HepG2-NE, ביטוי האדם NTCP).

דוגמנות דלקת כבד B וירוס ב-t-הפטיטיס 293T-NE-3NRs תאים

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

שכפול ויראלי HBV ב extrahepatic ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של תסמונות תשישות. נכון לעכשיו, מודלים של תרבות התאים להתחלת זיהום HBV חוץ-פתטי מוגבלים. אנו מציגים מודל זיהום במבחנה שאינו כבד כדי לסייע בזיהוי גורמים מארחים חדשניים המשפיעים על שכפול HBV ולחקור מחלות כליות הקשורות HBV.בהשוואה למודלים מסורתיים של זיהום HBV, אימצנו והנדסנו קו תאים של 293T, 293T-NE-3NR, ותרבתנו אותו במשותף עם HepG2.2.15. זיהום HBV צריך להתבצע במעבדה ברמה biosafety 2 או biosafety רמה שלוש. יש לעקוב אחר נוהלי בטיחות במעבדה כדי להבטיח את בטיחותם של אנשי המעבדה וכל החוקרים צריכים להיות מחוסנים ולזהות נוגדן HBS חיובי לפני ביצוע ניסויים HBV.התחל על ידי culturing התאים HepG2.2.15 תוך שמירה על כך על-טבעי התא, כמו גם את כל הטיפים, flasks, צלחות, צינורות שבאים במגע עם HepG2.2.15 צריך להיות ספוג 2%virucide לילה לפני סילוק. הסר את הבקבוקון המכיל HepG2.2.15 תאים מחנקן נוזלי ולהפשיר אותו מערבולת עדינה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את התאים לבקבוק תרבות רקמה מרובעת בגודל 25 ס"מ ומוסיפים ארבעה מיליליטר של מדיום תרבותי שלם.תרבות תאי HepG2.2.15 ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באינקובטור לח. שנה את המדיום כל שלושה ימים. כאשר מוכן, לאסוף את התא על טבעי בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.סגור את המכסה בחוזקה ועטוף אותו עם סרט פרפין. כדי להסיר את שברי התא, סנן את ה- HepG2.2.15 על-טבעי עם קרום 0.45 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 14 מיליליטר של על-טבעי מסונן לעמודת רכז וירוסים וסגרו את המכסה.צנטריפוגה הטור ב 3, 200 פעמים g במשך 35 דקות בצנטריפוגה מסתובב אופקי לאסוף את רכזת HepG2.2.15 על טבעי לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הפעל PCR בזמן אמת כדי להבטיח כי הריכוז אם ה-DNA HBV ברכז על-טבעי HepG2.2.15 נמצא בטווח העקומה הסטנדרטי. לדלל את הריכוז 20-פי על ידי הוספת 10 microliters ל 190 microliters של DMEM בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.יחד עם הריכוז העל-טבעי, הכינו שליטה שלילית, שליטה חיובית וארבעה דילולים של ההתייחסות הכמותית. הוסף 450 microliters של מאגר מיצוי DNA HBV לכל מדגם צנטריפוגה אותם ב 12, 000 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שלב 27 מיקרוליטרים של תערובת ראשית PCR ושלושה מיקרוליטרים של אנזים פולימראז Taq לכל מדגם בצינורות PCR המונחים על קרח.לאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוליטרים של הדגימה הצנטריפוגית לכל צינור. בצע PCR בזמן אמת בהתאם לכיווני כתב היד וייצא את ערכי ה- CT כדי להשיג עקומה סטנדרטית. מחלקים את רכזת ההפ-ג2.2.15 לאלקוטים ומאחסנים אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לשימוש.הכינו מדיום זיהום בהתאם לכיווני כתב היד. ואז זרע HepG2-NE בשתי בארות, 293T-NE-3NR תאים בשתי בארות, ו 293T-NE באר אחת. אין לארוב את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באינקובטור לח למשך 24 שעות.לאחר הדגירה, להתבונן בתאים ולהמשיך עם זיהום אם הם בריאים. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מתחם הזיהום לכל באר ו דגירה התאים עוד 24 שעות. לשטוף את התאים פעמיים עם 500 microliters של PBS.לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של בינוני לכל באר. משנים את המדיום בעדינות כל יומיים. ביום 11, בעדינות לשטוף את התאים פעמיים עם 500 microliters של PBS ולתקן את התאים עם מתנול קר כקרח עבור immunofluorescence.זרעים 100, 000 תאים לכל באר של HepG-NE לשתי בארות, 293T-NE-3NRs לשתי בארות, ו 293T-NE לתוך באר אחת של הצלחת. זרעים 100, 000 תאים לתוך באר של HepG2.2.15 לתוך חמישה ממברנה מוסיף בצלחת נפרדת שש בארות. דגירה התאים במשך 24 שעות.לאחר הדגירה, ודא כי התאים הם כל חסיד במצב טוב. השלך את המדיום בצלחת שש בארות ואת קרום התא מוסיף. לאחר מכן מניחים את מוסיף הממברנה עם HepG2.2.15 לתוך צלחת שש בארות זרע עם HepG-NE, 293T-NE-3NRs, ו 293T-NE.חגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באינקובטור לח, ומחליף את המדיום כל שלושה עד ארבעה ימים. לאחר 10 ימים, להסיר את ממברנה מוסיף, בעדינות לשטוף את התאים עם PBS פעמיים, ולתקן את התאים עם מתנול קר כקרח עבור immunofluorescence. הדגירה עם הנוגדן הראשי HBcAg ו DAPI הביא כתמים ברורים כאשר נצפתה עם מטרה 10X על מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטי.לוקליזציה גרעינית אושרה על ידי כתמים עם DAPI וביטוי NTCP-EGFP זוהה עם פלואורסצנטיות ירוקה. אתרי הביטוי של HBcAg היו ממוקמים עם פלואורסצנטיות אדומה. כאשר DAPI, NTCP ו- HBcAg נמצאים באותו תא, התא נדבק בהצלחה ב- HBV.הקבוצה Cyclosporin A הייתה הפקד השלילי מכיוון שהיא מונעת מ- HBV להזין תאים על-ידי חסימת NTCP. HBcAg זוהה ב 293T-NE-3NRs, אבל לא בתאי 293T-NE המציין NTCP אינו הגורם היחיד חיוני עבור זיהום HBV ב 293T. מצב תא טוב ותפעול יעיל הם נקודות המפתח להצלחת תוצאות הזיהום.כביסה עדינה ושינוי התקשורת לאחר ההדבקה חשוב גם. כחלופה, שיטת זיהום HBV עם תאי HepG2-NE מבוססי הפאטומה יש יעילות זיהום גבוהה יותר מאשר שיטה זו והוא מתאים הקרנת תרופות נגד HBV. מידול זיהום HBV ב 293T-NE-3NR היא מחמאה שימושית למודל התא המסורתי בשל הרקע הלא הכבד של תאים אלה.שיטה זו תקל על המחקר של זיהום HBV בתאים שאינם כבד, כמו גם גורמים מארחים הנדרשים עבור הכבד של HBV.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

דוגמנות מחזור החיים של נגיף האבולה תחת 2 תנאים ברמת בטיחות ביולוגיים עם חלקיקים כמו וירוס המכילים Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...