Name: modeling hepatitis b virus infection in non-hepatic 293t-ne-3nrs cells
Uploaded: 2020-06-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (nº 81870432 e 81570567 a X.L.Z.), (Nº 81571994 para P.N.S.), Fundo de Pesquisa para Jovens Cientistas Internacionais (nº 81950410640 a W.I.); Fundação Universidade Li Ka Shing Shantou (Nº. L1111 2008 para P.N.S.). Gostaríamos de agradecer ao Prof. Stanley Lin da Faculdade de Medicina da Universidade de Shantou por conselhos úteis.

Cultura, coleta de supernacantes de células HepG2.2.15 e infecção por HBV devem ser realizadas no laboratório de biossegurança II (P2) ou biossegurança III (P3) de acordo com a orientação de biossegurança no país. As práticas de segurança laboratorial devem ser seguidas para garantir a segurança do pessoal do laboratório, e todos devem ser vacinados e detectados HBsAb positivo antes de realizar experimentos de HBV. Observe o estado das células a cada passo antes de prosseguir para o próximo passo. As amos...

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	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+hepatitis+report,+2017.">Global hepatitis report, 2017.</a> World Health Organization. , (2017).</li><li>Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+hepatitis+B+virus+DNA+sequences+in+patients+with+acute+hepatitis+B+infection.">Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection.</a> Hepatology. 12, 187-192 (1990).</li><li>Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+replication+in+diverse+cell+types+during+chronic+hepatitis+B+virus+infection.">Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection.</a> Hepatology. 18, 781-789 (1993).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+is+a+functional+receptor+for+human+hepatitis+B+and+D+virus.">Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.</a> eLife. 1, 00049 (2012).</li><li>Tang, H., McLachlan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+hepatitis+B+virus+by+nuclear+hormone+receptors+is+a+critical+determinant+of+viral+tropism.">Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).</li><li>Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatitis+B+virus+particles+in+Hep+G2+cells+transfected+with+cloned+hepatitis+B+virus+DNA.">Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).</li><li>Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+intermediates+of+hepatitis+B+virus+in+HepG2+cells+that+produce+infectious+virions.">Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions.</a> Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).</li><li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter,+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP).">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+host+factors+support+HBV+infection+in+non-hepatic+293T+cells.">Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells.</a> Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Model+Systems+for+Hepatitis+B+Virus+Research.">In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).</li><li>Liang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B:+the+virus+and+disease.">Hepatitis B: the virus and disease.</a> Hepatology. 49, 13-21 (2009).</li><li>Nie, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+hepatitis+B+virus-host+interactions+in+liver+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).</li><li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+kidney+organoids:+progress+and+remaining+challenges.">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).</li></ol>

Aqui, introduzimos protocolos para infecção por HBV em células Hepáticas 293T-NE-3NRs e hepatoma baseadas em HepG2-NE. 293T-NE-3NRs foram adequados para infecção por HBV tanto no Alto quanto no Baixo GEq. As seguintes etapas críticas devem ser levadas em consideração ao usar nosso protocolo. O estado celular é um fator importante para uma infecção bem sucedida. O meio de infecção deve ser alterado oportunamente após o período inicial de infecção por HBV. As células 293T-NE-3NRs são tipicamente frágei...

A hepatite B afeta a vida de mais de 2 bilhões de pessoas e é uma das maiores ameaças à saúde pública. Aproximadamente 257 milhões de pessoas estão cronicamente infectadas com o vírus da hepatite B (HBV) em todo o mundo, causando um grande fardo para a sociedade1. Os hepatócitos não são as únicas células infectadas pelo HBV e outras células em tecido não hepático, como rim e testíase, também são infectados por este vírus2,,3. Atualmente, os modelos de células de infecção por HBV estão limitados a hepatócitos humanos com apenas poucos modelos de linha celular não hepática. Isso dificulta o estudo da infecção por HBV e da patologia relacionada ao HBV de tecidos não hepáticos. Aqui apresentamos protocolos para estudar a infecção por HBV em células 293T não hepáticas, bem como em células baseadas em hepatoma.
O polipeptídeo de co-transporte de taurocolato de sódio (NTCP) é um receptor funcional para hepatite B humana e vírus da hepatite D4. Fator nuclear hepatocito 4α (HNF4α), receptor X retinóide α (RXRα) e receptor ativado por proliferador peroxiso α (PPARα) são fatores de transcrição enriquecidos pelo fígado que restringem o tropismo viral do HBV. Eles foram verificados para promover a síntese de RNA pregenomic HBV e apoiar a replicação do HBV em uma linha celular não hepatoma5. Construímos três linhas celulares diferentes, linhas celulares HepG2 expressando NTCP (HepG2-NE), linha celular 293T expressando linha NTCP (293T-NE) e linha celular 293T expressando quatro genes hospedeiros; NTCP, HNF4α, RXRα e PPARα (293T-NE-3NRs). Dois métodos para infecção por HBV foram desenvolvidos com base em 293T-NE-3NRs(Figura 1). O primeiro método utiliza a inoculação em 293T-NE-3NRs com alta equivalência do genoma viral (GEq alto (150), DMSO e PEG8000) por 24 h. O segundo método emprega co-cultivar 293T-NE-3NRs com HepG2.2.15, que podem produzir partículas HBV (baixo GEq (cerca de 1,83) sem DMSO e PEG8000), assim emulando de perto as condições naturais.
As células hepG2.2.15 são derivadas da linha HepG2 e secretam cronicamente o HBV infeccioso, bem como partículas subvirais no meio da cultura6,,7. Ciclosporina A (CsA) é um imunossupressor clinicamente utilizado para a supressão da rejeição de xenoenxerto. Estudos têm demonstrado que a CSA inibe a entrada de HBV em hepatócitos cultivados inibindo a atividade de transporte do NTCP e bloqueando a vinculação do NTCP às grandes proteínas envelope8.
As células hepG2-NE foram utilizadas como controle positivo, enquanto as células tratadas com CIA foram utilizadas como controle negativo. Comparando-se com os grupos de controle positivos e negativos, podemos descobrir quais genes hospedeiros desempenham um papel crítico na infecção pelo HBV. Além disso, através deste modo de infecção por HBV, também podemos encontrar outros novos mecanismos ou genes de hospedagem envolvidos na infecção pelo HBV.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45&#956;m membrane filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RB</td>
			<td>Filter for HepG 2.2.15 supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T-NE</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T-NE-3NRs</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>594 labeled goat against rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For immunofluorescence assay,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP010006</td>
			<td>For co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td>For concentration of HepG 2.2.15 supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023</td>
			<td>For immunofluorescence assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin A</td>
			<td>Sangon biotech</td>
			<td>59865-13-3</td>
			<td>inhibitor of HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)</td>
			<td>DAAN GENE</td>
			<td>7265-2013</td>
			<td>For HBV DNA detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClong</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For improvement of infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#65288;FBS&#65289;</td>
			<td>CLARK Bioscience</td>
			<td>FB25015</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio observer Z1</td>
			<td>For immunofluorescence assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2-NE</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBcAg antibody</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZA-0121</td>
			<td>For immunofluorescence assay, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td>For cell wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P8260</td>
			<td>For infection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3412</td>
			<td>For co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Douban</td>
			<td>6971728840012</td>
			<td>Viruside</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling hepatitis b virus infection in non-hepatic 293t-ne-3nrs cells

O HBV infecta principalmente hepatócitos humanos, mas também foi encontrado para infectar tecidos extraháticos, como rim e testíase. No entanto, os modelos de HBV baseados em células estão limitados a linhas celulares hepatoma (como HepG2 e Huh7) superexpressando um receptor HBV funcional, polipeptídeo de taurocolato de sódio (NTCP). Aqui, usamos 293T-NE-3NRs (293T superexpressando NTCP humano, HNF4α, RXRα e PPARα) e HepG2-NE (HepG2 superexpressando NTCP) como linhas de célula modelo.   A infecção por HBV nessas linhas celulares foi realizada utilizando partículas concentradas do vírus HBV de HepG2.2.15 ou co-culminando hepG2.2.15 com as linhas celulares-alvo. A imunofluorescência HBcAg para HBcAg foi realizada para confirmar a infecção pelo HBV. Os dois métodos aqui apresentados nos ajudarão a estudar a infecção pelo HBV em linhas celulares não hepáticas.

Construímos plasmid pSIN-NTCP-EGFP expressando fusão NTCP e EGFP e com resistência à puramicina. O plasmídeo foi transfectado em células HepG2 e 293T para construir linhas de células estáveis HepG2-NE e 293T-NE expressando NTCP e EGFP. Plasmids (pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-bandeira) com resistência e expressão de puromicina foram transfectados em células 293T-NE para construir uma linha celular estável expressando 4 genes hospedeiros9. A expressão do NTCP-EGFP pode ser ob...

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Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV) em novas células 293T (293T-NE-3NRs, expressando NTCP humano, HNF4α, RXRα e PPARα) e células hepáticas tradicionais (HepG2-NE, expressando NTCP humano).

Modelagem da infecção por vírus da hepatite B em células não hepáticas 293T-NE-3NRs

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A replicação viral do HBV no extraheptico desempenha um papel importante na patogênese das síndromes extrahepépticas. Atualmente, os modelos de cultura celular para iniciar a infecção por HBV extraháptica são limitados. Apresentamos um modelo de infecção in vitro não hepática para ajudar a identificar novos fatores hospedeiros que afetam a replicação do HBV e investigar doenças renais relacionadas ao HBV.Em comparação com os modelos tradicionais de infecção por HBV, adotamos e projetamos a linha celular 293T, 293T-NE-3NR, e co-cultivado com HepG2.2.15. A infecção por HBV deve ser realizada em um laboratório de biossegurança nível dois ou biossegurança três. As práticas de segurança laboratorial devem ser seguidas para garantir a segurança do pessoal do laboratório e de todos os pesquisadores devem ser vacinados e detectar o anticorpo HBS positivo antes de realizar experimentos de HBV.Comece por estar o HepG2.2.15 células tendo em mente que a supernasce celular, bem como todas as pontas, frascos, placas e tubos que entram em contato com HepG2.2.15 devem ser encharcados em 2% de virucida durante a noite antes do descarte. Remova o frasco contendo células HepG2.2.15 de nitrogênio líquido e descongele-o em um suave redemoinho em um banho de água de 37 graus Celsius. Transfira as células para um frasco de cultura de tecido quadrado de 25 centímetros e adicione quatro mililitros de meio de cultura completa.Cultura as células HepG2.2.15 a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono em uma incubadora umidificada. Troque o meio a cada três dias. Quando estiver pronto, colete a célula sobrenana em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.Feche a tampa com firmeza e enrole-a com filme de parafina. Para remover os fragmentos celulares, filtre o supernatante HepG2.2.15 com uma membrana de 0,45 micrômetros em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, adicione 14 mililitros de supernaca filtrado a uma coluna concentradora de vírus e feche a tampa.Centrifugar a coluna a 3.200 vezes g por 35 minutos em uma centrífuga giratória horizontal e coletar o concentrado de supernasal HepG2.2.15 em um tubo de 1,5 mililitro. Execute o PCR em tempo real para garantir que a concentração se o DNA HBV no concentrado supernacante HepG2.2.15 estiver dentro da faixa de curva padrão. Diluir o concentrado 20 vezes adicionando 10 microliters a 190 microliters de DMEM em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Juntamente com o concentrado supernante, prepare um controle negativo, controle positivo e quatro diluições da referência quantitativa. Adicione 450 microliters de tampão de extração de DNA HBV a cada amostra e centrífuga-os a 12.000 vezes g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Combine 27 microliters de mix mestre PCR e três microliters de enzima de polimerase Taq por amostra em tubos PCR colocados no gelo.Em seguida, adicione 20 microliters da amostra centrífuga em cada tubo. Realize o PCR em tempo real de acordo com as instruções do manuscrito e exporte os valores do CT para obter uma curva padrão. Divida o concentrado supernacante HepG2.2.15 em alíquotas e armazene-o a menos 80 graus Celsius até estar pronto para usar.Prepare o meio de infecção de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, semente HepG2-NE em dois poços, 293T-NE-3NR células em dois poços, e 293T-NE em um bem. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada por 24 horas.Após a incubação, observe as células e proceda com a infecção se estiverem saudáveis. Adicione 500 microliters do complexo de infecção a cada poço e incuba as células por mais 24 horas. Lave as células duas vezes com 500 microliters de PBS.Em seguida, adicione um mililitro de médio a cada poço. Troque o meio suavemente a cada dois dias. No dia 11, lave suavemente as células duas vezes com 500 microliters de PBS e fixe as células com metanol gelado para imunofluorescência.Semente 100.000 células por poço de HepG-NE em dois poços, 293T-NE-3NRs em dois poços, e 293T-NE em um poço da placa. Sementes 100.000 células por poço de HepG2.2.15 em cinco inserções de membrana em uma placa separada de seis poços. Incubar as células por 24 horas.Após a incubação, certifique-se de que as células são todas aderentes e em bom estado. Descarte o meio na placa de seis poços e nas pastilhas da membrana celular. Em seguida, coloque as pastilhas de membrana com HepG2.2.15 na placa de seis poços semeada com HepG-NE, 293T-NE-3NRs e 293T-NE.Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada, mudando o meio a cada três ou quatro dias. Após 10 dias, remova as pastilhas de membrana, lave suavemente as células com PBS duas vezes e fixe as células com metanol gelado para imunofluorescência. A incubação com o anticorpo primário HBcAg e o DAPI resultou em uma coloração distinta quando observada com um objetivo de 10X em um microscópio invertido fluorescente.A localização nuclear foi confirmada por coloração com expressão DAPI e NTCP-EGFP foi identificada com fluorescência verde. Os locais de expressão de HBcAg foram localizados com fluorescência vermelha. Quando DAPI, NTCP e HBcAg estão na mesma célula, a célula foi infectada com sucesso com HBV.O grupo Ciclosporina A foi o controle negativo porque impede o HBV de entrar nas células bloqueando o NTCP. O HBcAg foi detectado em 293T-NE-3NRs, mas não em células 293T-NE indicando que o NTCP não é o único fator essencial para a infecção pelo HBV em 293T. Bom status celular e operação eficiente são os pontos-chave para obter resultados de infecção bem sucedidos.Lavar suavemente e mudar a mídia após a infecção também é importante. Como alternativa, o método de infecção por HBV com células HepG2-NE baseadas em hepatoma tem maior eficiência de infecção do que este método e é adequado para a triagem de medicamentos anti-HBV. Modelar a infecção por HBV em 293T-NE-3NR é um elogio útil ao modelo celular tradicional devido ao fundo não hepático dessas células.Este método facilitará o estudo da infecção por HBV em células não hepáticas, bem como fatores hospedeiros necessários para o fígado de HBV.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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that ...

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Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

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Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Deteção de cópia baixa número de DNA Viral integrado formado por In Vitro infecção de hepatite B

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"Fígado-on-a-Chip" culturas de hepatócitos primários e células de Kupffer para infecção pelo vírus da hepatite B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...