Name: modeling hepatitis b virus infection in non-hepatic 293t-ne-3nrs cells
Uploaded: 2020-06-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81870432 ve 81570567 X.L.Z.), (No. 81571994 P.N.S.), Uluslararası Genç Bilim Adamları Araştırma Fonu (No. 81950410640-W.I.); Li Ka Shing Shantou Üniversitesi Vakfı (No. L1111 2008 için P.N.S.). Shantou Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Prof. Stanley Lin'e faydalı tavsiyeler için teşekkür ederiz.

Kültür, HepG2.2.15 hücrelerinden süpernatants toplama ve HBV enfeksiyonu ülkedeki biyogüvenlik rehberliğine göre biyogüvenlik düzeyi II (P2) veya biyogüvenlik seviyesi III (P3) laboratuvarında yapılmalıdır. Laboratuvar personelinin güvenliğini sağlamak için laboratuvar güvenlik uygulamaları takip edilmeli ve HBV deneyleri yapmadan önce tüm aşılar ve HBsAb pozitif saptanmalıdır. Bir sonraki adıma geçmeden önce her adımda hücrelerin durumunu gözlemleyin. Shantou Üniversitesi Tıp Fakültes...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+hepatitis+report,+2017.">Global hepatitis report, 2017.</a> World Health Organization. , (2017).</li><li>Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+hepatitis+B+virus+DNA+sequences+in+patients+with+acute+hepatitis+B+infection.">Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection.</a> Hepatology. 12, 187-192 (1990).</li><li>Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+replication+in+diverse+cell+types+during+chronic+hepatitis+B+virus+infection.">Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection.</a> Hepatology. 18, 781-789 (1993).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+is+a+functional+receptor+for+human+hepatitis+B+and+D+virus.">Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.</a> eLife. 1, 00049 (2012).</li><li>Tang, H., McLachlan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+hepatitis+B+virus+by+nuclear+hormone+receptors+is+a+critical+determinant+of+viral+tropism.">Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).</li><li>Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatitis+B+virus+particles+in+Hep+G2+cells+transfected+with+cloned+hepatitis+B+virus+DNA.">Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).</li><li>Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+intermediates+of+hepatitis+B+virus+in+HepG2+cells+that+produce+infectious+virions.">Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions.</a> Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).</li><li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter,+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP).">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+host+factors+support+HBV+infection+in+non-hepatic+293T+cells.">Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells.</a> Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Model+Systems+for+Hepatitis+B+Virus+Research.">In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).</li><li>Liang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B:+the+virus+and+disease.">Hepatitis B: the virus and disease.</a> Hepatology. 49, 13-21 (2009).</li><li>Nie, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+hepatitis+B+virus-host+interactions+in+liver+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).</li><li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+kidney+organoids:+progress+and+remaining+challenges.">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).</li></ol>

Burada hepatik olmayan 293T-NE-3NR ve hepatom bazlı HepG2-NE hücrelerinde HBV enfeksiyonu için protokoller sokulduk. 293T-NE-3NR hem yüksek hem de düşük GEq'da HBV enfeksiyonu için uygundu. Protokolümüzü kullanırken aşağıdaki kritik adımların göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Hücre durumu başarılı bir enfeksiyon için önemli bir faktördür. HBV enfeksiyonunun başlangıç döneminden sonra enfeksiyon ortamı zamanında değiştirilmelidir. 293T-NE-3NR hücreleri genellikle yüksek viral ...

Hepatit B 2 milyardan fazla insanın hayatını etkiler ve halk sağlığıiçin en büyük tehditlerden biridir. Yaklaşık 257 milyon kişi kronik hepatit B virüsü ile enfekte (HBV) dünya çapında, toplum için büyük bir yük neden1. Hepatositler hbv ve diğer hücreler tarafından enfekte olmayan karaciğer dokusu, böbrek ve testis gibi enfekte sadece hücreler değildir, ayrıca bu virüs tarafından enfekte2,3. Şu anda, HBV enfeksiyon hücre modelleri sadece birkaç non-hepatik hücre hattı modelleri ile insan hepatositleri ile sınırlıdır. Bu, hepatik olmayan dokuların HBV enfeksiyonu ve HBV ile ilişkili patolojisinin çalışmasını engellemektedir. Burada hepatik olmayan 293T hücrelerinde ve hepatom bazlı hücrelerde HBV enfeksiyonu incelemek için protokoller salıyoruz.
Sodyum taurokolate co-transporting polipeptid (NTCP) insan hepatit B ve hepatit D virüsü için fonksiyonel bir reseptördür4. Hepatosit nükleer faktör 4α (HNF4α), retinoid X reseptörα (RXRα) ve peroksizom proliferator aktive reseptör α (PPARα) HBV viral tropizmkısıtlar karaciğer zenginleştirilmiş transkripsiyon faktörleridir. HbV pregenomik RNA sentezini teşvik etmek ve nonhepatom anormal hücre hattı5HBV replikasyonunu desteklemek için doğrulanmıştır. NTCP (HepG2-NE), NTCP (293T-NE) ve dört konak geni ifade eden 293T hücre hattını ifade eden HepG2 hücre hattı olmak üzere üç farklı hücre hattı inşa ettik; NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα (293T-NE-3NR). HBV enfeksiyonu için 293T-NE-3NR(Şekil 1)temel alınabilmektedir. İlk yöntem 293T-NE-3NR'de yüksek viral genom eşdeğerliği (yüksek GEq (150), DMSO ve PEG8000) 24 saat boyunca aşılama yöntemidir. İkinci yöntem, HBV partiküllerini (düşük GEq (yaklaşık 1,83) DMSO ve PEG8000 olmadan üretebilen ve böylece doğal koşulları yakından taklit eden HepG2.2.15'li 293T-NE-3NR'leri ortak olarak kullanır.
HepG2.2.15 hücreleri HepG2 hattından elde edilir ve kronik olarak enfeksiyöz HBV salgılar, ayrıca kültür ortamına subviral partiküller6,7. Siklosporin A (CsA) klinik olarak ksenogreft rekontisyonunun bastırılmasında kullanılan bir immünsupresandır. Çalışmalar, CsA'nın NTCP'nin taşıyıcı aktivitesini inhibe ederek ve NTCP'nin büyük zarf proteinlerine bağlanmasını engelleyerek HBV'nin kültürlü hepatositlere girişini engellediğini göstermiştir8.
HepG2-NE hücreleri pozitif kontrol olarak, CsA tedavi edilen hücreler ise negatif kontrol olarak kullanıldı. Pozitif ve negatif kontrol grupları ile karşılaştırarak, hangi konak genlerin HBV enfeksiyonunda kritik bir rol oynadığını bulabiliriz. Ayrıca, HBV enfeksiyonu bu modu ile, biz de diğer yeni mekanizmalar veya EV sahibi genler HBV enfeksiyonu dahil bulabilirsiniz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45&#956;m membrane filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RB</td>
			<td>Filter for HepG 2.2.15 supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T-NE</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T-NE-3NRs</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>594 labeled goat against rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For immunofluorescence assay,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP010006</td>
			<td>For co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td>For concentration of HepG 2.2.15 supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023</td>
			<td>For immunofluorescence assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin A</td>
			<td>Sangon biotech</td>
			<td>59865-13-3</td>
			<td>inhibitor of HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)</td>
			<td>DAAN GENE</td>
			<td>7265-2013</td>
			<td>For HBV DNA detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClong</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For improvement of infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#65288;FBS&#65289;</td>
			<td>CLARK Bioscience</td>
			<td>FB25015</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio observer Z1</td>
			<td>For immunofluorescence assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2-NE</td>
			<td>Laboratory construction</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>Cell model for HBV infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBcAg antibody</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZA-0121</td>
			<td>For immunofluorescence assay, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td>For cell wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P8260</td>
			<td>For infection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td>For culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3412</td>
			<td>For co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Douban</td>
			<td>6971728840012</td>
			<td>Viruside</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling hepatitis b virus infection in non-hepatic 293t-ne-3nrs cells

HBV esas olarak insan heatositlerini enfekte eder, ancak böbrek ve testis gibi ekstrahepatik dokulara da bulaşabilmekte bulunmuştur. Bununla birlikte, hücre bazlı HBV modelleri hepatoma hücre hatları ile sınırlıdır (HepG2 ve Huh7 gibi) fonksiyonel BIR HBV reseptörü aşırı ifade, sodyum taurokolate co-transporting polipeptid (NTCP). Burada 293T-NE-3NR (293T aşırı insan NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα) ve HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) model hücre hatları olarak kullandık.   Bu hücre hatlarındaki HBV enfeksiyonu ya HepG2.2.15'teki konsantre HBV virüs parçacıkları kullanılarak ya da hepg2.2.15'i hedef hücre hatları ile birlikte örme ile gerçekleştirildi. HBV enfeksiyonunu doğrulamak için HBcAg immünoresans iması yapıldı. Burada sunulan iki yöntem, hepatik olmayan hücre hatlarında HBV enfeksiyonu çalışmamıza yardımcı olacaktır.

PSIN-NTCP-EGFP plazmidini ifade eden NTCP ve EGFP füzyonu ve püromisin direnci ni inşa ettik. Plazmid, HepG2-NE ve 293T-NE hücre hatları ntcp ve EGFP ifade kararlı hücre hatları oluşturmak için HepG2 ve 293T hücrelerine transfeced oldu. Pomisin direnci ve ekspresyonu olan plazmidler (pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-flag) 293T-NE hücrelerine dönüştürülerek 4 konak geni ifade eden kararlı bir hücre hattı oluşturmak için9. NTCP-EGFP ifadesi yeşil floresan tarafından g...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells at JoVE.com

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

Bu el yazması, insan NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα'yı ifade eden 293T-NE-3NR' ler ve geleneksel hepatik hücreler (HepG2-NE, insan NTCP'yi ifade eden) yeni mühendislik temalı 293T hücreleri (293T-NE-3NR) enfeksiyonu için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Hepatik Olmayan 293T-NE-3NR Hücrelerinde Hepatit B Virüs Enfeksiyonunun Modelilmesi

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

Ekstrahepatik hbv viral replikasyon ekstrahepatik sendromların patogenezinde önemli rol oynar. Şu anda ekstrahepatik HBV enfeksiyonu başlatmak için hücre kültürü modelleri sınırlıdır. HBV replikasyonunu etkileyen yeni konak faktörlerinin belirlenmesine ve HBV'ye bağlı böbrek hastalıklarının araştırılmasına yardımcı olmak için in vitro hepatik olmayan bir enfeksiyon modeli saiyoruz.Geleneksel HBV enfeksiyon modelleri ile karşılaştırıldığında, 293T hücre hattı, 293T-NE-3NR'yi benimsedik ve tasarladık ve HepG2.2.15 ile birlikte kültürlendik. HBV enfeksiyonu biyogüvenlik düzeyi iki veya biyogüvenlik düzeyi üç laboratuvarda yapılmalıdır. Laboratuvar personelinin güvenliğini sağlamak için laboratuvar güvenlik uygulamaları takip edilmeli ve tüm araştırmacılar HBV deneyleri yapmadan önce aşılı olmalı ve HBS antikor pozitifini saptamalıdır.HepG2.2.15 hücrelerini, hücre süpernatantYanı sıra tüm ipuçları, şişeler, plakalar ve HepG2.2.15 ile temas tüpleri bertaraf edilmeden önce bir gecede% 2 virucide batırılmış gerektiğini akılda tutarak culturing başlayın. Sıvı nitrojen den HepG2.2.15 hücreleri içeren şişe çıkarın ve 37 derece santigrat su banyosunda nazik girdap içinde eritin. Hücreleri 25 santimetre karelik doku kültürü şişesine aktarın ve dört mililitre tam kültür ortamı ekleyin.Kültür HepG2.2.15 hücreleri 37 santigrat derece ve 5% karbondioksit nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi. Ortamı her üç günde bir değiştirin. Hazır olduğunda, 50 mililitrelik bir santrifüj tüp hücre supernatant toplamak.Kapağı sıkıca kapatın ve parafin film ile sarın. Hücre parçalarını çıkarmak için, Yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüp içine 0,45 mikrometre membran ile HepG2.2.15 supernatant filtre. Daha sonra bir virüs yoğunlaştırıcı sütuna 14 mililitre filtrelenmiş supernatant ekleyin ve kapağı kapatın.Sütunu 3, 200 kez g'de yatay bir dönen santrifüjde 35 dakika bekleyin ve HepG2.2.15 supernatant konsantresini 1,5 mililitrelik bir tüpe toplayın. HepG2.2.15 supernatant konsantresindeki HBV DNA'sının standart eğri aralığında olması durumunda konsantrasyonun gerçek zamanlı PCR'yi çalıştırın. 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe 190 mikrolitre DMEM'e 10 mikrolitre ekleyerek konsantreyi 20 kat seyreltin.Supernatant konsantresi ile birlikte, negatif bir kontrol, pozitif kontrol ve nicel referans dört seyreltme hazırlamak. Her numuneye 450 mikrolitre HBV DNA ekstraksiyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 12,000 kez g'de santrifüj edin. 27 mikrolitre PCR ana karışımını ve buz üzerine yerleştirilen PCR tüplerinde numune başına üç mikrolitre Taq polimeraz enzimini birleştirin.Daha sonra her tüpe santrifüjlü numunenin 20 mikrolitresini ekleyin. El yazması talimatlara göre gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin ve standart bir eğri elde etmek için CT değerlerini dışa aktarın. HepG2.2.15 supernatant konsantresini aliquots'a bölün ve kullanıma hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.El yazması talimatlara göre enfeksiyon ortamı hazırlayın. Sonra tohum HepG2-NE iki kuyuda, 293T-NE-3NR hücreleri iki kuyuda, ve 293T-NE bir kuyuda. Hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın ve nemlendirilmiş bir kuvözde %5 karbondioksit 24 saat boyunca.Kuluçkadan sonra hücreleri gözlemleyin ve sağlıklılarsa enfeksiyona devam edin. Her kuyuya enfeksiyon kompleksinin 500 mikrolitresini ekleyin ve hücreleri 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Hücreleri 500 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın.Sonra her kuyuya bir mililitre orta ekleyin. Orta yı iki günde bir hafifçe değiştirin. 11. günde, hücreleri 500 mikrolitre PBS ile yavaşça yıkayın ve immünoresans için buz gibi metanol ile hücreleri düzeltin.Tohum 100, Iki kuyu içine HepG-NE kuyu başına 000 hücreleri, iki kuyu içine 293T-NE-3NR, ve 293T-NE plaka bir kuyu içine. Tohum 100, 000 hücre hepG2.2.15 ayrı bir altı-iyi plaka beş membran ekler içine kuyu başına. Hücreleri 24 saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, hücrelerin tüm yapışık ve iyi durumda olduğundan emin olun. Altı kuyu plaka ve hücre zarı ekler orta atın. Daha sonra HepG2.2.15 ile membran kesici uçları HepG-NE, 293T-NE-3NR ve 293T-NE ile tohumlanmış altı kuyuplakasına yerleştirin.Hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın ve her üç ila dört günde bir ortamı değiştirin. 10 gün sonra, membran kesici uçlarını çıkarın, hücreleri pbs ile iki kez hafifçe yıkayın ve immünoresans için buz gibi metanol ile hücreleri düzeltin. HBcAg primer antikor ve DAPI ile kuluçka, floresan ters mikroskopta 10X hedefi ile gözlendiğinde belirgin bir boyama ile sonuçlandı.Nükleer lokalizasyon DAPI ile boyama ile doğrulandı ve NTCP-EGFP ekspresyonu yeşil floresan ile tespit edildi. HBcAg'ın ekspresyonu kırmızı floresan ile tespit edilmiştir. DAPI, NTCP ve HBcAg aynı hücrede yken, hücre başarılı bir şekilde HBV ile enfekte olmuştur.Siklosporin A grubu, HBV'nin NTCP'yi engelleyerek hücrelere girmesini engellediği için negatif kontrol oldu. HBcAg 293T-NE-3NR'lerde saptandı, ancak NTCP'nin 293T'deki HBV enfeksiyonu için gerekli olan tek faktör olmadığını gösteren 293T-NE hücrelerinde saptanmadı. İyi hücre durumu ve verimli çalışma başarılı enfeksiyon sonuçları almak için önemli noktalardır.Enfeksiyon sonrası ortamın nazik çehresinin yıkanması ve değiştirilmesi de önemlidir. Alternatif olarak hepatom bazlı HepG2-NE hücreleri ile HBV enfeksiyon yöntemi bu yönteme göre daha yüksek enfeksiyon verimliliğine sahiptir ve anti-HBV ilaç taraması için uygundur. 293T-NE-3NR hbv enfeksiyonu modelleme bu hücrelerin hepatik olmayan arka plan nedeniyle geleneksel hücre modeli için yararlı bir iltifat olduğunu.Bu yöntem, hepatik olmayan hücrelerde HBV enfeksiyonunun yanı sıra HBV karaciğeri için gerekli konak faktörlerinin araştırılmasını kolaylaştıracaktır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Tetracistronic minigenomlar İçeren virüs benzeri partiküller ile Biyogüvenlik Seviyesi 2 Koşullarında Ebola virüsü Ömrü Modelleme

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Algılama düşük kopya sayısı Vitro hepatit B enfeksiyonu tarafından kurulan entegre Viral DNA

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...