Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

ويقر المؤلفون بالدعم المالي المقدم من المجلس الوطني للبحوث في كندا.

وقد وافق مجلس الأخلاقيات التابع للجنة النرويجية على جميع التجارب التي أجريت في هذه الدراسة التي شملت عينات بشرية، وتمت وفقاً لسياسات اللجنة التنظيمية النووية التي تحكم المواضيع البشرية التي تتبع المبادئ التوجيهية للبحوث المعمول بها وتمتثل للقوانين المعمول بها في كيبيك، كندا.
<p class="jove...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

البروتوكول التجريبي المعروض والأساليب تسمح لdPCR في المنزل باستخدام مولد قطرات TPE ملفقة، ودورة حرارية، والمجهر الفلورانس. الجهاز ملفقة باستخدام TPE لينة إلى TPE الترابط يتيح خصائص سطح الماء التي هي موحدة عبر جميع جدران القناة، بحيث الجهاز النهائي لا يتطلب أي معالجة السطح للاستخدام اللاحق كمو...

تحليل تكوين خلايا الدم البيضاء (WBCs) هو من بين الاختبارات المختبرية المطلوبة في كثير من الأحيان في التشخيص الدموي. يعتبر عدد الكريات البيض التفاضلي بمثابة مؤشر لطائفة من الأمراض بما في ذلك العدوى والالتهابات وفقر الدم وسرطان الدم ، وهو قيد التحقيق كعلامة بيولوجية تنبؤية مبكرة للعديد من الحالات الأخرى أيضًا. معيار الذهب في شرك WBC ينطوي على مناعة و / أو تدفق استئصال الدراجات على حد سواء التي تتطلب مكلفة، غير استقرار الأجسام المضادة الفلورية، وغالبا ما تعتمد اعتمادا كبيرا على كفاءة المشغل في إعداد العينة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة تنطبق على عينات الدم الطازجة فقط، بحيث لا يمكن تجميد العينات للشحن أو التحليل اللاحق.
ظهرت مؤخراً علامات اللاجينية كأدوات تحليلية قوية لدراسة الاختلافات الظاهرية. وفي وقت لاحق، تبين أن مجموعات الكريات البيض البشرية لديها أنماط لتلوين الحمض النووي لخلايا تسمح بالتأسم الدقيق للمجموعات الفرعية للWBC. subtyping على أساس علامات اللاجينية يوفر بديلا واعدا لا يعتمد على جمع عينة الدم الطازجة أو الأجسام المضادة باهظة الثمن ويمكن استغلالها كعلامة حيوية لظهور المرض والحساسية1،2،3،4،5.
وقد أجريت دراسات على نطاق الجينوم من أجل رسم خرائط واسعة النطاق لمناطق محددة ميثيلية من المناطق الغنية بـ CG في الجينوم (جزر Cpg) في أنواع فرعية من الكريات البيض لتحديد علامات اللاجينية المرشحة الخاصة بالأنماط الفرعية الكريات البيض. وقد تم تطوير بروتوكولات PCR لهذا السبب لمناطق الجينات الميثيلية، مثل CD3Z و FOXP3، المقابلة لـ CD3+ T-Cells و CD4+ CD25+ الخلايا T-التنظيمية (T-Regs) على التوالي. وقد أظهرت Wiencke وآخرون فائدة من الوتير PCR مزدوجة من أجل subtyping اللاجينية من الخلايا T، مما أسفر عن نتائج التي ترتبط ارتباطا كبيرا مع تدفق الخلايا النشطة الفرز (FACS) تحليل6. تعتمد طريقة التحليل الجيني الكمي هذه على تقسيم جزيئات الحمض النووي القالب والكواشف PCR إلى آلاف من منفصلة، الحجمية المعرفة، دون نانولتر الحجم قطرات الحجم التي تحتوي على صفر، واحد أو أكثر من النسخ الحمض النووي الهدف، وذلك باستخدام مستحلبات المياه في النفط التي مكنها microfluidics7،8. ويتم إجراء تضخيم PCR داخل كل قطرة على حدة ويتم قياس شدة الفلورية نقطة النهاية لكل قطرة، مما يسمح بالتقمّد الكمي المطلق للأهداف الموجودة في العينة. وقد تم إنشاء القطيرة PCR لتكون أكثر دقة ودقة، وأبسط من الناحية الفنية من qPCR القياسية، مما يجعلها أكثر ملاءمة الحمض النووي على أساس طريقة القائمة على التقييم السريري للخلايا T. على الرغم من أن منهجية فرعية الناشئة بسرعة ، وتحليل متعدد اللاجينية للتحقيق لمختلف المناطق Cpg الميثيلية في وقت واحد غير موجود. وهذا ضروري للعد التفاضلي الكريات البيض الروتينية.
هنا، يتم تقديم جهاز ميكروفلورويديك ميكروفلورويدي للبلاستيك اللدائن الحرارية (TPE) واستخدامها في وحدات PCR متعددة الوميضات الخاصة بالميثيل (mdPCR). وقد استخدمت هذه التكنولوجيا لتحديد أنواع فرعية معينة من الكريات البيض، CD3+ T-Cells و CD4+ CD25+ T-Regs، استناداً إلى أنماط صبغة الحمض النووي الخلوي، أي التباين اللاجيني لمناطق CD3Z وFOXP3 CpG على التوالي. يوصف بروتوكول مفصل لاستخراج الحمض النووي وتحويل البيسولفيت وmdPCR بالتنسيق مع طريقة تصنيع لجهاز توليد قطرات TPE. وتقارن النتائج التمثيلية لهذه الطريقة بنتائج تلطيخ الفلوروس المناعي الذي يبرز فائدة النهج المقترح.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

ويرد وصف لسير عمل متعدد التكرار (mdPCR) وبروتوكول مفصل لتحديد الخلايا الدم البيضاء المستندة إلى اللاجينية (WBC) تفاضلية، جنبا إلى جنب مع مولد الدران الحراري (TPE) microfluidic جيل الجهاز. وتستخدم علامات اللاجينية لcC subtyping الذي هو من قيمة التكهن الهامة في أمراض مختلفة. ويتحقق ذلك من خلال القياس الكمي لأنماط المثيلات بالحمض النووي لمناطق معينة غنية بـ CG في الجينوم (Cpg loci). في هذه الورقة، يتم تغليف الحمض النووي المعالج بالثنائية الفقار من خلايا الدم أحادية النوى الطرفية (PBMCs) في قطرات مع كواشف mdPCR بما في ذلك الاعوئ والمسبارات الفلورية التحللية المائية المحددة لـ Cpg loci التي ترتبط مع مجموعات السكان الفرعية WBC. ويسمح نهج تعدد الخواص باستجواب العديد من مراكز Cpg loci دون الحاجة إلى تفاعلات منفصلة من المعالجة بالنظم المتعددة البروم في المواد الكيميائية، مما يتيح تحديد أكثر دقة للسكان شبه المحيطيين باستخدام التحليل اللاجيني لمواقع المثيل. ويمكن توسيع نطاق هذا القياس الكمي الدقيق إلى تطبيقات مختلفة ويسلط الضوء على فوائد التشخيص السريري والتكهن اللاحق.

تم تصنيع جهاز مولدات قطرات ميكروفلورويديك القائم على TPE باستخدام البروتوكول الموصوف كما هو موضح في الشكل 1. تم استخدام قناع الشفافية في التصوير الضوئي للحصول على السيليكون (سي) الماجستير. تم إجراء الطباعة الحجرية لينة للحصول على نسخة طبق الأصل PDMS العكسي من سيد Si الذي كان يس?...

Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

وتستخدم علامات اللاجينية لخلايا الدم البيضاء (WBC) subtyping من خلال القياس الكمي للأنماط المثيلة الحمض النووي. يقدم هذا البروتوكول طريقة تفاعل سلسلة البوليمرات القطرة المتعددة (mdPCR) باستخدام جهاز مرقّم حراري (TPE) قائم على microfluidic لتوليد القطرات مما يسمح بالتخصيص الكمي الدقيق والمضاعف للميثيل المحدد للعد التفاضلي WBC.

Methylation محددة متعددة القطرية PCR باستخدام بوليمر جهاز مولد قطرة لتشخيص الدم

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

يقدم هذا البروتوكول سير عمل مرن متعدد المرونة PCR الذي يسمح بالعد الدقيق للكريات الكريات البيض التفاضلية استنادًا إلى علامات المثيلات اللاجينية. قد تسهل هذه المرونة ترجمة mdPCR نحو الاستخدام السريري. يوفر هذا الأسلوب النتائج التي الاستعلام عن كثب لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام أساليب التلطيخ المناعي.على عكس التلطيخ المناعي، ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لا تتطلب عينات دم جديدة أو أجسام مضادة مكلفة. في التشخيص الدمي، يمكن أن تكون الكريات البيض التفاضلية بمثابة مؤشرات لطائفة من الأمراض، بما في ذلك العدوى والالتهاب وفقر الدم وسرطان الدم، ويجري النظر في ذلك كعلامة بيولوجية سرطانية مبكرة. ومن خلال عملية البرهان على هذا الإجراء مع عبد الرحمن إلمزالاوي، ستكون كريستينا ناصيف، المسؤولة الفنية من فريقنا في مركز أبحاث الأجهزة الطبية التابع للجنة.تبدأ من قبل خلط دقيق 20 ميكرولترات من البروتين كيناز K و 400 ميكرولترات من عازلة الربط تحلل التي تحتوي على الخرز المغناطيسي مع ذوبان حديثا الخلايا أحادية النواة الدم الطرفية البشرية في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. بعد فترة حضانة مدتها خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل إزالة المابير. مع إزالة الأنبوب من المغناطيس ، وإعادة تعليق مجمع حبة الحمض النووي في 600 ميكرولترات من غسل العازلة واحدة لإزالة أي خرز غير ملزمة على وجه التحديد.وضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس للسماح لإزالة من عظمى، قبل غسل الخلايا في 600 ميكرولترات من العازلة غسل اثنين كما هو موضح للتو. بعد إزالة supernatant، والسماح للأنبوب لتجف الهواء على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة قبل إضافة 100 ميكرولترات من عازلة elution إلى الأنبوب مع خلط شامل. ثم ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقة إلى دقيقتين لفصل الخرز المغناطيسي عن الحمض النووي الملمح، ونقل محلول الحمض النووي المنقى إلى أنبوب جديد.لتحويل الـ(بيسولفيت) للحمض النووي المنقى، قم بنقل 20 ميكرولترات من عينة الحمض النووي الملمحة إلى أنبوب PCR، وإضافة 130 ميكرولترات من كاشف التحويل إلى الأنبوب. بعد خلط شامل، تدور لفترة وجيزة أسفل محتويات الأنبوب وتضخيم الحمض النووي على دورة حرارية. في نهاية الدورة، إضافة 600 ميكرولترات من العازلة ملزمة لعمود الكروماتوغرافيا أيون وضعت في أنبوب جمع، وإضافة الحمض النووي إلى العمود.عكس أنبوب عدة مرات لخلط، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية في أقصى سرعة. تجاهل التدفق الذي تم جمعه من خلال، وإضافة 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت للغسيل إلى العمود. الطرد المركزي العمود وتجاهل تدفق من خلال مرة أخرى كما ثبت.إضافة 200 ميكرولترات من عازلة إزالة الكبريت إلى العمود لاحتضان 15 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، قبل الطرد المركزي للعينة والتخلص من تدفق من خلال كما هو موضح. بعد ذلك، قم بغسل العمود مرتين بـ 200 ميكرولتر من عازل الغسيل في الغسيل. بعد الغسيل الثاني، قم بنقل العمود إلى أنبوب جمع جديد 1.5 ملليلتر، وإضافة 100 ميكرولترات من الماء الصف PCR إلى غشاء العمود.ثم، elute الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي للعمود لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة. لتوليد قطرات، مزيج ميكرولتر واحد من الحمض النووي المحولة من البيسولفيت مع المزيج الرئيسي مسبار أعدت حديثا في أنبوب PCR، وجمع العينة مع الطرد المركزي وجيزة. استخدام تركيبات الذروة لتوصيل أنابيب سائلة يمكن التخلص منها إلى اثنين من الحقن الزجاجية الدقيقة 250 ميكرولتر الحجم.وتعبئة ما قبل حقنة واحدة الزجاج الدقيق مع 250 ميكرولترات من النفط الناقل تحتوي على 5٪ flouro السطحي، وحقنة واحدة الزجاج الدقيق مع 50 ميكرولترات من زيت الناقل. عندما تم تحميل كل من الحقن، تحميل 100 ميكرولترات من مزيج PCR في حقنة من النفط الناقل، ووضع جهاز microfluidic قطرات على خشبة المسرح من المجهر الضوء تستقيم مجهزة كاميرا عالية السرعة. لمراقبة وتسجيل تكوين قطرات في الوقت الحقيقي، ضع المحاقن المعبأة مسبقا على مضخة حقنة قابلة للبرمجة، واستخدام الاتحاد الذروة مع التجهيزات لربط أنابيب الحقن إلى أنابيب قنوات مدخل كل منها من الجهاز microfluidic قطرات.ضع الأنابيب من منفذ مولد القطرات إلى داخل أنبوب PCR 0.5 ملليلتر ، وضبط معدل تدفق مضخة الحقنة إلى اثنين من ميكرولترات في الدقيقة ، للسماح لحجم القطرات بالستقرار قبل جمع المستحلب الناتج. ببطء وبعناية جمع مستحلب من أعلى الأنبوب، ونقل 75 ميكرولترات من الحل إلى 200 ميكرولتر PCR أنبوب للدراجات الحرارية. ثم، تأكد من أن محتوى النفط في أنبوب PCR يطابق عن كثب حجم المرحلة المشتتة، لمنع اندماج القطرات أثناء الدراجات الحرارية، ووضع أنبوب 200 ميكرولتر في دورة حرارية.بالنسبة للتصوير المفلور للعينة المستحلبة، قم بنقل مستحلب البوليستر إلى أنبوب شعري عميق يبلغ 50 ميكرومتر بوروسيليكات مع تشكيل جانبي مستطيل، للسماح بترتيب القطرات إلى طبقة أحادية معبأة قريبة للتصوير. بعد تحديد وختم الشعيرات الدموية على شريحة المجهر، تحميل الشريحة على خشبة المسرح من المجهر المقلوب. وفي برنامج التصوير المجهر، حدد الحصول على ويعيش بسرعة، لبدء اقتناء الكاميرا في الوقت الحقيقي.ثم، مراقبة العينة تحت حقل مشرق والمجهر الفلوريسنس. بعد توليد القطرات وركوب الدراجات الحرارية، يمكن إدخال القطرات في الشعيرات الدموية الزجاجية بعرض ملليمتر واحد وارتفاع 50 ميكرومتر. للحصول على توزيع أحادي الطبقات من قطرات مثالية للحصول على صورة الفلوريسين، يمكن بعد ذلك تسجيل الصور لكل طول موجي.بعد تحليل الصورة، يمكن رسم شدة الفلوريسنس لجميع قطرات في الفلوروفورات الخاصة بهم لتحديد عتبة قطرات إيجابية وسلبية. بعد تحديد الهوية والعد، يمكن حساب النسخ لكل قيم قطرات، ويمكن تحديد النسبة المئوية لـ CD3+T-cells، وC4+25+الخلايا التائية التنظيمية على أساس نسخ CD3Z و FOXP3 الميثيلتين على التوالي، فيما يتعلق بالنسخ لكل قطرة من الخلايا الكلية أو الجين C-less. ويمكن بعد ذلك مقارنة القيم في المئة لتلك التي تم الحصول عليها من خلال التصوير المناعي باستخدام الأجسام المضادة المناسبة.أعتقد أن استقرار المستحلب من جيل القطرات من خلال الدراجات الحرارية وخطوات التصوير النهائية للقطر أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج دقيقة وموثوقة وقابلة للتكرار. يمكن استخدام تخصيص MD PCR من خلال تركيبة مزيج PCR مصممة خصيصًا لعدد من التطبيقات بما في ذلك أبحاث السرطان وتشخيص الأمراض المعدية والتحليلات على مستوى الخلية المفردة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

ارتفاع جانبي MicroRNA المناولة : ملتيبليكس محسن qRT - PCR على مقياس نانولتر في المحفل Fluidigm ArrayTM الحيوي

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

طرق الكشف عن منصات مضان الحبرية ميكروفلويديك

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

مضان الانتعاش بعد دمج قطرات لقياس انتشار ثنائي الأبعاد من الفوسفوليبيدية واحد رقائق

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

تعميم الرنا الميكروي الكمي باستخدام الحمض النووي ملزم صبغ الكيمياء والقطرة PCR الرقمية

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

المغنطيسى إلى جانب التصوير المحمولة وتحليل لتشخيص الأمراض

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

الأمثل للتحليل متعدد التعبير المستندة إلى الجيش الملكي النيبالي استخدام المواد الأرشيفية سرطان الثدي

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

اتباع نهج موائع جزيئية المستندة إلى الحبرية والتضخيم ميكروسفيري-بكر للحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل أمبليكونس

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors للكشف عن حوزتي النشاط في فيفو لتشخيص موسع

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...