Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Forfatterne anerkender finansiel støtte fra National Research Council of Canada.

Alle de forsøg, der blev udført i denne undersøgelse med humane prøver, blev godkendt af NRC's Etiske Råd og blev udført i henhold til NRC's politikker for humane forsøgspersoner, der følger gældende forskningsretningslinjer og er i overensstemmelse med lovgivningen i Québec, Canada.
1. Celleforberedelse
<ol><li>Tø straks de frosne perifere humane blodmonnukle celler (PBMC' er) op ved at anbringe kryovialen i et vandbad ved 37 °C i 5 min.</li>
	<li>Inverter kryovial to gange for ...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

Den præsenterede eksperimentelle protokol og metoder giver mulighed for in-house mdPCR ved hjælp af en fabrikeret TPE dråbe generator, en termisk cycler, og fluorescens mikroskop. Den fabrikerede enhed ved hjælp af blød TPE til TPE limning giver hydrofobiske overfladeegenskaber, der er ensartede på tværs af alle kanalvægge, således at den endelige enhed ikke kræver nogen overfladebehandling til efterfølgende brug som en dråbe generator. Dette materiale er rutinemæssigt anvendt i point-of-care platforme , der...

Analyse af hvide blodlegemer (WBCs) sammensætning er blandt de hyppigst efterspurgte laboratorieundersøgelser i hæmatologisk diagnostik. Differential leukocyt tæller tjener som en indikator for et spektrum af sygdomme, herunder infektion, betændelse, anæmi, og leukæmi, og er under efterforskning som en tidlig prognose biomarkør for flere andre betingelser samt. Guld standard i WBC subtyping indebærer immunstaining og / eller flow cytometri, som begge kræver dyre, ustabilitet-tilbøjelige fluorescerende antistoffer og er ofte meget afhængige af operatørens færdigheder i prøve forberedelse. Desuden gælder denne metode kun for friske blodprøver, således at prøverne ikke kan indefryses til forsendelse eller senere analyse.
Epigenetiske markører har for nylig vist sig som kraftfulde analytiske værktøjer til undersøgelse af fænokomypiske variationer. Efterfølgende, humane leukocyt populationer har vist sig at have celle-afstamning DNA methylering mønstre, der giver mulighed for den præcise karakterisering af WBC delmængder. Subtyping baseret på epigenetiske markører giver et lovendealternativ,der ikke afhænger af frisk blodprøvetagning eller dyre antistoffer og kan udnyttes som biomarkør for sygdomsdebutog modtagelighed 1,2,3,4,5.
Genom-dækkende undersøgelser er blevet udført for omfattende kortlægning af methylerede specifikke CG-rige regioner i genomet (CpG øer) i leukocyt undertyper til at identificere kandidat epigenetiske markører specifikke for leukocyt undertyper. PCR-protokoller er blevet udviklet på grund af denne grund til methylerede genregioner, f.eks.+ + + Wiencke et al. har vist nytten af duplex dråbe PCR for epigenetiske subtyping af T-celler, hvilket giver resultater, der er meget korrelerer med flow aktiveret celle sortering (FACS) analyse6. Denne kvantitative genetiske analysemetode er baseret på at opdele skabelonen nukleinsyre molekyler og PCR reagenser i tusindvis af diskrete, volumetrically defineret, sub-nanoliter størrelse dråber, der indeholder nul, en eller flere mål nukleinsyre kopier, ved hjælp af vand-i-olie emulsioner aktiveret af microfluidics7,8. PCR-forstærkningen udføres inden for hver enkelt dråbe, og slutpunktsfluorescensintensiteten for hver dråbe måles, hvilket giver mulighed for absolut kvantificering af de mål, der er til stede i prøven. Droplet PCR er blevet etableret for at være mere præcis, præcis og teknisk enklere end standard qPCR, hvilket gør det til en mere gunstig DNA methylering-baseret metode til klinisk evaluering af T-celler. Selv om en hurtigt spirende subtyping metode, multiplexed epigenetisk analyse til sonde for forskellige methylerede CpG regioner samtidig mangler. Dette er nødvendigt for rutinemæssige leukocyt differentialetal.
Heri præsenteres og anvendes en termoplastisk elastomer (TPE) dråbemikrinikan og anvendes til methyleringsspecifik multiplexdråbe PCR (mdPCR). Teknologien er blevet brugt til at afgrænse specifikke leukocyt undertyper, CD3+ T-celler og CD4+ CD25+ T-Regs, baseret på celle-lineage DNA methylering mønstre, dvs epigenetiske variation af CD3Z og FOXP3 CpG regioner, hhv. En detaljeret protokol for DNA-ekstraktion, bisulfitkonvertering og mdPCR er beskrevet i samarbejde med en fabrikationsmetode for en TPE dråbegenereringsenhed. Repræsentative resultater af metoden sammenlignes med resultaterne af immunfluorescensfarvning, der fremhæver nytten af den foreslåede fremgangsmåde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

En multiplexed dråbe PCR (mdPCR) workflow og detaljeret protokol til bestemmelse af epigenetisk-baserede hvide blodlegemer (WBC) differentialetal er beskrevet, sammen med en termoplastisk elastomer (TPE) microfluidic dråbe generation enhed. Epigenetiske markører bruges til WBC subtyping som er af vigtig prognoseværdi i forskellige sygdomme. Dette opnås ved kvantificering af DNA-methyleringsmønstre for specifikke CG-rige regioner i genomet (CpG loci). I dette papir indkapsles bisulfitbehandlet DNA fra perifere blodmonukleare celler (PBPC'er) i dråber med mdPCR-reagenser, herunder primere og hydrolyselyorescerende sonder, der er specifikke for CpG loci, der korrelerer med WBC-delpopulationer. Multiplex-tilgangen gør det muligt at forhøre mange CpG loci uden behov for separate mdPCR-reaktioner, hvilket muliggør en mere præcis parametrisk bestemmelse af WBC-delpopulationer ved hjælp af epigenetisk analyse af methyleringssteder. Denne præcise kvantificering kan udvides til forskellige applikationer og fremhæver fordelene ved klinisk diagnose og efterfølgende prognose.

Den TPE-baserede mikrofluidiske dråbegeneratorenhed blev fremstillet ved hjælp af den beskrevne protokol som vist i figur 1. En gennemsigtighed maske blev brugt i fotolitografi for at opnå silicium (Si) master. Soft litografi blev udført for at opnå en omvendt PDMS kopi af Si master, som derefter blev brugt til at fremstille epoxy skimmel. Epoxy forløber blev hældt på PDMS og hærdet til crosslink og hærde. Denne form, der repræsenterer den nøjagtige kopi af Si master var mere mod...

Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Epigenetiske markører anvendes til hvide blodlegemer (WBC) subtyping gennem kvantificering af DNA methylering mønstre. Denne protokol præsenterer en multiplex dråbe polymerase kædereaktion (mdPCR) metode ved hjælp af en termoplastisk elastomer (TPE)-baserede microfluidic enhed til dråbe generation giver mulighed for præcise og multiplex methylation-specifikke mål kvantificering af WBC differentialetal.

Methylering Specifikke Multiplex Dråbe PCR ved hjælp af Polymer Dråbe Generator Device for hæmatologisk diagnostik

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Denne protokol præsenterer en fleksibel multiplex dråbe PCR workflow, der tillader præcis differential leukocyt optælling baseret på epigenetiske methylering markører. Denne fleksibilitet kan lette oversættelsen af mdPCR til klinisk brug. Denne metode giver resultater, der nøje forespørger til dem, der opnås ved hjælp af immunfluorescerende farvning metoder.I modsætning til immunfluorescerende farvning, men denne metode kræver ikke friske blodprøver eller dyre antistoffer. I hæmatologisk diagnostik, differential leukocyt kan tjene som indikatorer for et spektrum af sygdomme, herunder infektion, betændelse, anæmi og leukæmi, og betragtes som en tidlig prognostisk kræft biomarkør. Demonstration af proceduren med Abdelrahman Elmanzalawy vil være Christina Nassif, en teknisk officer fra vores team på NRC's Medical Device Research Centre.Begynd med grundigt at blande 20 mikroliter proteinkinase K og 400 mikroliter lysisbindingsbuffer, der indeholder magnetiske perler med frisk optøede perifere blodmonukleare celler hos 100 mikroliter PBS. Efter fem minutters inkubation ved stuetemperatur anbringes røret på et magnetisk stativ i et til to minutter, før supernatanten fjernes. Med røret fjernet fra magneten, re-suspendere DNA perle kompleks i 600 mikroliter af vask buffer en til at fjerne eventuelle ikke-specifikt bundet perler.Anlå røret tilbage på magneten for at gøre det muligt at fjerne supernatanten, før cellerne vaskes i 600 mikroliter af vaskepude to, som det netop er påvist. Efter fjernelse af supernatanten skal røret lufttørres på magneten i et minut, før der tilsættes 100 mikroliter af elution buffer til røret med grundig blanding. Derefter placeres røret på den magnetiske rist i et til to minutter for at adskille de magnetiske perler fra det hentydede DNA og overføre den rensede DNA-opløsning til et nyt rør.Ved omdannelse af bisulfit overføres 20 mikroliter af den hentydede DNA-prøve til et PCR-rør, og der tilsættes 130 mikroliter konverteringsreagesalt til røret. Efter grundig blanding, kort dreje ned røret indholdet og forstærke DNA på en termisk cycler. Ved slutningen af cyklussen tilsættes 600 mikroliter bindingsbuffer til en ionkromatografikolonne placeret i et samlingsrør, og dna'et til kolonnen.Inverter røret flere gange for at blande og centrifuge i 30 sekunder ved fuld hastighed. Kassér det indsamlede flow igennem, og tilsæt 100 mikroliter vaskebuffer til kolonnen. Centrifuge kolonnen og kassér flow-through igen som påvist.Der tilsættes 200 mikroliter Desulfonationsbuffer til kolonnen i en 15 til 20 minutters inkubation ved stuetemperatur, før prøven centrifugeres, og gennemstrømningen kasseres som påvist. Dernæst vaskes kolonnen to gange med 200 mikroliter vaskepude pr. vask. Efter den anden vask overføres kolonnen til et nyt 1,5 milliliteropsamlingsrør, og der tilsættes 100 mikroliter PCR-vand til kolonnens membran.Derefter eluter DNA ved centrifugering af kolonnen i et minut ved fuld hastighed. Til dråbegenerering blandes en mikroliter bisulfit-konverteret DNA med frisklavet sondemasterblanding i et PCR-rør, og prøven opsamres med en kort centrifugering. Brug peak fittings til at forbinde engangsvæskerør til to 250-mikroliter volumen præcision glas sprøjter.Og forfyld en præcisionsglassprøjte med 250 mikroliter bæreolie indeholdende 5 % flouro overfladeaktivt stof og en præcisionsglassprøjt med 50 mikroliter bæreolie. Når begge sprøjterne er blevet indlæst, skal du lægge 100 mikroliter af PCR-blandingen i sprøjten med bæreolie og placere en dråbemikrofluidisk anordning på scenen af et opretstående lysmikroskop udstyret med et højhastighedskamera. Til observation og registrering af dråbedannelse i realtid skal de fyldte sprøjter på en programmerbar sprøjtepumpe og bruge topunion med beslag til at forbinde sprøjternes slange til slangen på de respektive indløbskanaler på dråbens mikrofluidiske anordning.Anlækker slangen fra udløbsgeneratoren til indersiden af et 0,5 milliliter PCR-rør, og juster sprøjtepumpens strømningshastighed til to mikroliter pr. minut, så dråbestørrelsen stabiliseres, før den resulterende emulsion opsamler. Langsomt og forsigtigt indsamle emulsion fra toppen af røret, og overføre 75 mikroliter af opløsningen til en 200 microliter PCR rør til termisk cykling. Bekræft derefter, at olieindholdet i PCR-røret nøje svarer til mængden af den spredte fase for at forhindre sammenspaltning af dråberne under termisk cykling, og ans anbringer 200 mikroliterrøret i den termiske cykelr.Ved fluorescensbilleddannelse af den emulgeret prøve overføres PCR-emulsionen til et 50-mikrometer dybt borosilikat kapillærrør med en rektangulær profil for at muliggøre placering af dråberne i et tætpakket monolag til billeddannelse. Efter fastgørelse og forsegling af kapillærerne på et mikroskop dias, indlæse dias på scenen af det omvendte mikroskop. Og i mikroskop billedbehandling software, skal du vælge erhverve og leve hurtigt, for at starte real-time kamera erhvervelse.Derefter observere prøven under lyse felt og fluorescens mikroskopi. Efter dråbegenerering og termisk cykling kan dråberne indføres i en glaskapillær med en en millimeter bredde og en 50-mikrometerhøjde. For at opnå en monolayer fordeling af dråber, der er ideel til fluorescens billede erhvervelse, kan billeder derefter optages for hver bølgelængde.Efter billedanalyse kan fluorescensintensiteten af alle dråberne i deres respektive fluorophores afbildes for at fastsætte tærsklen for de positive og negative dråber. Efter identifikation og optælling kan kopierne pr. dråbeværdier beregnes, og procentdelen af CD3+T-celler og CD4+25+regulatoriske T-celler kan bestemmes på grundlag af henholdsvis methylerede CD3Z- og FOXP3-kopier med hensyn til kopierne pr. dråbe af det samlede celler eller C-less-genet. Procentværdierne kan derefter sammenlignes med dem, der opnås ved immunfluorescensbilleddannelse ved hjælp af de relevante antistoffer.Jeg tror, at emulsionsstabiliteten fra dråbegenereringen gennem de termiske cykel- og sidste dråbebilleddannelsestrin er afgørende for at opnå præcise, pålidelige og reproducerbare kvantificeringsresultater. MD PCR tilpasning gennem skræddersyet PCR mix formulering kan bruges til en række applikationer, herunder kræftforskning, infektionssygdomme diagnose og analyser på enkelt celleniveau.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescenspåvisning metoder for mikrofluide dråbe platforme

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescens Recovery efter Sammenlægning en Droplet at Mål Todimensional Diffusion af et Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescens Detection for Droplet Microfluidics Brug af optiske fibre

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Cirkulerende MicroRNA Kvantificering Brug DNA-bindende Dye Kemi og Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Magnetisk Levitation Sammen med Portable Imaging og Analyse for sygdomsdiagnostik

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimering af en Multiplex RNA-baserede udtryk analyse ved hjælp af bryst kræft arkivalier

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

En dråbe mikrofluid tilgang og Microsphere-PCR-amplifikation til enkeltstrenget DNA amplikoner

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Sensorer til at registrere Protease aktivitet In Vivo for invasiv diagnostik

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...