Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

De auteurs erkennen financiële steun van de National Research Council of Canada.

Alle experimenten die in deze studie met menselijke monsters werden uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Ethische Raad van de NRC en werden uitgevoerd volgens het beleid van NRC ten aanzien van menselijke proefpersonen die de toepasselijke onderzoeksrichtlijnen volgen en voldoen aan de wetten in Québec, Canada.
1. Celvoorbereiding
<ol><li>Ontdooi de bevroren menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMCs) onmiddellijk door het cryoviale in een waterbad op 37 °C gedurende 5 minuten te...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

De gepresenteerde experimentele protocol en methoden zorgen voor in-house mdPCR met behulp van een vervaardigde TPE druppelgenerator, een thermische cycler, en fluorescentie microscoop. Het vervaardigde apparaat met behulp van zachte TPE aan TPE binding biedt hydrofobe oppervlakte-eigenschappen die uniform zijn over alle kanaalwanden, zodanig dat het uiteindelijke apparaat geen oppervlaktebehandeling nodig heeft voor later gebruik als druppelgenerator. Dit materiaal is routinematig gebruikt in point-of-care platforms die...

Analyse van de samenstelling van witte bloedcellen (BBC's) is een van de meest gevraagde laboratoriumtests in hematologische diagnostiek. Differentiële leukocytentelling dient als een indicator voor een spectrum van ziekten, waaronder infectie, ontsteking, bloedarmoede en leukemie, en wordt onderzocht als een vroege prognostische biomarker voor verschillende andere aandoeningen ook. De gouden standaard in WBC-subtypering omvat immunostaining en/of stroomcytometrie die beide dure, instabiliteitsgevoelige fluorescerende antilichamen vereisen en vaak sterk afhankelijk zijn van de vaardigheid van de operator bij het bereiden van monsters. Bovendien is deze methode alleen van toepassing op monsters van vers bloed, zodat de monsters niet kunnen worden ingevroren voor verzending of latere analyse.
Epigenetische markers zijn onlangs naar voren gekomen als krachtige analytische instrumenten voor de studie van fenotypische variaties. Vervolgens, menselijke leukocyten populaties zijn aangetoond dat cel-lijn DNA-methylatie patronen die het mogelijk maken voor de precieze karakterisering van WBC subsets. Subtypering op basis van epigenetische markers biedt een veelbelovend alternatief dat niet afhankelijk is van het verzamelen van vers bloedmonsters of dure antilichamen en kan worden gebruikt als biomarker voor ziekteafname en gevoeligheid1,2,3,4,5.
Genoombrede studies zijn uitgevoerd voor het uitgebreid in kaart brengen van gemethyleerde specifieke CG-rijke gebieden in het genoom (CpG-eilanden) in leukocyten subtypen om kandidaat-epigenetische markers te identificeren die specifiek zijn voor leukocyten subtypen. Vanwege deze reden zijn PCR-protocollen ontwikkeld voor gemethyleerde gengebieden, zoals CD3Z en FOXP3, wat overeenkomt met cd3+ T-cellen en CD4+ CD25+ Regulatory T-Cells (T-Regs). Wiencke et al. hebben aangetoond dat duplexdruppel PCR voor epigenetische subtypering van T-Cellen, resultaten die sterk correleren met flow activated cell sorting (FACS) analyse6. Deze kwantitatieve genetische analysemethode is gebaseerd op het verdelen van de sjabloon nucleïnezuurmoleculen en PCR-reagentia in duizenden discrete, volumetrimlijk gedefinieerde druppels met een subnanoliter grootte die nul, een of meer doelnucleïnezuurkopieën bevatten, met behulp van water-in-olie emulsies die door microfluidica7,8worden ingeschakeld . De PCR-versterking wordt uitgevoerd binnen elke afzonderlijke druppel en de eindpuntfluorescentieintensiteit van elke druppel wordt gemeten, waardoor absolute kwantificering van de in het monster aanwezige doelen mogelijk is. Druppel PCR is vastgesteld om nauwkeuriger, nauwkeuriger en technisch eenvoudiger dan standaard qPCR, waardoor het een gunstiger DNA methylatie-gebaseerde methode voor klinische evaluatie van T-Cellen. Hoewel een snel opkomende subtypering methodologie, multiplexed epigenetische analyse te sonde voor verschillende gemethyleerde CpG regio's tegelijkertijd ontbreekt. Dit is nodig voor routinematige leukocyten differentieel telt.
Hierin wordt een thermoplastisch elastomer (TPE) druppelmicrofluïdisch apparaat gepresenteerd en gebruikt voor methylatiespecifieke multiplex druppel PCR (mdPCR). De technologie is gebruikt om specifieke leukocyten subtypes, CD3+ T-Cells en CD4+ CD25+ T-Regs af te bakenen, gebaseerd op cellijn DNA methylatiepatronen, d.w.z. epigenetische variatie van cd3z en FOXP3 CpG regio's, respectievelijk. Een gedetailleerd protocol voor DNA-extractie, bisulfite conversie en mdPCR wordt beschreven in overleg met een fabricagemethode voor een TPE druppelgeneratie apparaat. Representatieve resultaten van de methode worden vergeleken met die van immunofluorescentie vlekken benadrukken het nut van de voorgestelde aanpak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

Een multiplexed druppel PCR (mdPCR) workflow en gedetailleerd protocol voor het bepalen van epigenetische gebaseerde witte bloedcel (WBC) differentieel telling wordt beschreven, samen met een thermoplastische elastomer (TPE) microfluïde druppelgeneratie apparaat. Epigenetische markers worden gebruikt voor WBC subtypering die van belangrijke prognostische waarde is bij verschillende ziekten. Dit wordt bereikt door de kwantificering van DNA-methylatiepatronen van specifieke CG-rijke gebieden in het genoom (CpG loci). In dit document, bisulfite behandeld DNA van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) is ingekapseld in druppels met mdPCR reagentia met inbegrip van primers en hydrolyse fluorescerende sondes specifiek voor CpG loci die correleren met WBC sub-populaties. De multiplex benadering maakt het mogelijk voor de ondervraging van veel CpG loci zonder de noodzaak van afzonderlijke mdPCR reacties, waardoor meer nauwkeurige parametrische bepaling van WBC sub-populaties met behulp van epigenetische analyse van methylatie sites. Deze nauwkeurige kwantificering kan worden uitgebreid tot verschillende toepassingen en benadrukt de voordelen voor klinische diagnose en de daaropvolgende prognose.

De op TPE gebaseerde microfluidic druppelgeneratorapparaat werd vervaardigd volgens het beschreven protocol zoals weergegeven in figuur 1. Een transparantiemasker werd gebruikt in fotolithografie om silicium (Si) meester te verkrijgen. Zachte lithografie werd uitgevoerd om een omgekeerde PDMS replica van de Si master die vervolgens werd gebruikt om de epoxy mal te fabriceren verkrijgen. Epoxy voorloper werd gegoten op de PDMS en genezen om crosslink en verharden. Deze mal, die de exacte repl...

Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Epigenetische markers worden gebruikt voor witte bloedcellen (WBC) subtypering door de kwantificering van DNA-methylatiepatronen. Dit protocol presenteert een multiplex druppelpolymeerkettingreactie (mdPCR) methode met behulp van een thermoplastische elastomer (TPE) gebaseerd microfluïde apparaat voor druppelgeneratie waardoor nauwkeurige en multiplex methylatie-specifieke doelkwantificering van WBC differentiële telt.

Methylatiespecifieke Multiplex Droplet PCR met polymeerdruppelgenerator voor hematologische diagnostiek

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Dit protocol presenteert een flexibele multiplex druppel PCR workflow die nauwkeurige differentiële leukocyten tellen op basis van epigenetische methylatie markers mogelijk maakt. Deze flexibiliteit kan de vertaling van mdPCR naar klinisch gebruik vergemakkelijken. Deze methode biedt resultaten die nauw opvragen bij degenen die zijn verkregen met behulp van immunofluorescente kleuringsmethoden.In tegenstelling tot immunofluorescente kleuring, echter, deze methode vereist geen verse bloedmonsters of dure antilichamen. In hematologische diagnostiek kan differentieel leukocyte dienen als indicatoren voor een spectrum van ziekten, waaronder infectie, ontsteking, bloedarmoede en leukemie, en wordt beschouwd als een vroege prognostische kanker biomarker. Het demonstreren van de procedure met Abdelrahman Elmanzalawy zal Christina Nassif zijn, een technisch medewerker van ons team van nrc's Medical Device Research Centre.Begin met het grondig mengen van 20 microliter eiwitkinase K en 400 microliter lysisbindbuffer met magnetische kralen met vers ontdooide menselijke perifere bloedmonopoliecellen in 100 microliter van PBS. Na een vijf minuten durende incubatie bij kamertemperatuur, plaats de buis op een magnetisch rek gedurende een tot twee minuten voor het verwijderen van de supernatant. Met de buis verwijderd uit de magneet, opnieuw opschorten het DNA-kraal complex in 600 microliters van wasbuffer een om niet-specifiek gebonden kralen te verwijderen.Plaats de buis terug op de magneet om verwijdering van de supernatant mogelijk te maken, voordat u de cellen in 600 microliter wasbuffer twee wast, zoals net is aangetoond. Laat de buis na het verwijderen van de supernatant gedurende een minuut een minuut drogen voordat u 100 microliter elutiebuffer aan de buis toevoegt met grondig mengen. Plaats vervolgens de buis gedurende één tot twee minuten op het magnetische rek om de magnetische kralen van het gezinspeelde DNA te scheiden en breng de gezuiverde DNA-oplossing over naar een nieuwe buis.Voor bisulfie conversie van het gezuiverde DNA, breng 20 microliter van het gezinspeelde DNA-monster naar een PCR-buis, en voeg 130 microliters van conversie reageagensage aan de buis. Na grondig mengen, kort spin vaststelling van de buis inhoud en versterken van het DNA op een thermische cycler. Voeg aan het einde van de cyclus 600 microliter bindingsbuffer toe aan een ionenchromatografiekolom die in een verzamelingsbuis is geplaatst en voeg het DNA toe aan de kolom.Keer de buis meerdere malen om te mengen, en centrifuge gedurende 30 seconden op volle snelheid. Gooi de verzamelde stroom door en voeg 100 microliter wasbuffer toe aan de kolom. Centrifugeren de kolom en gooi de flow-through weer zoals aangetoond.Voeg 200 microliter desulfonatiebuffer toe aan de kolom voor een incubatie van 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur, voordat u het monstercentrifugeert en de doorstroom weggooit zoals aangetoond. Was vervolgens de kolom twee keer met 200 microliters wasbuffer per wasbeurt. Breng na de tweede wasbeurt de kolom over naar een nieuwe opvangbuis van 1,5 milliliter en voeg 100 microliter pcr-water toe aan het membraan van de kolom.Dan, ontwijk het DNA door centrifugatie van de kolom gedurende een minuut op volle snelheid. Voor druppelgeneratie, meng een microliter van bisulfite-omgezet DNA met vers voorbereide sonde master mix in een PCR buis, en het monster te verzamelen met een korte centrifugatie. Gebruik piekarmaturen om wegwerpvloeieige buizen aan te sluiten op twee 250 microliter volume precisie glassyspuiten.En vul een precisieglasspuit voor met 250 microliter dragerolie die 5% flouro oppervlakteactieve stoffen bevat, en een precisieglasspuit met 50 microliter dragerolie. Wanneer beide spuiten zijn geladen, laad 100 microliters van de PCR in de spuit van draagolie en plaats een druppelmicrofluïdisch apparaat op het podium van een rechtopstaande lichtmicroscoop uitgerust met een hoge snelheidscamera. Voor de observatie en opname van druppelvorming in real time plaatst u de voorgevulde spuiten op een programmeerbare spuitpomp en gebruikt u piekunie met fittingen om de slang van de spuiten aan te sluiten op de slang van de respectieve inlaatkanalen van het druppelmicrofluïde apparaat.Plaats de slang van de uitlaat van de druppelgenerator aan de binnenkant van een 0,5 milliliter PCR-buis en pas de stroomsnelheid van de spuitpomp aan op twee microliters per minuut, zodat de druppelgrootte kan stabiliseren voordat de resulterende emulsie wordt verzameld. Langzaam en zorgvuldig verzamelen van de emulsie van de bovenkant van de buis, en breng 75 microliter van de oplossing naar een 200 microliter PCR buis voor thermische fietsen. Bevestig vervolgens dat het oliegehalte in de PCR-buis nauw overeenkomt met het volume van de verspreide fase, om coalescence van de druppels tijdens het thermische fietsen te voorkomen en plaats de 200 microliterbuis in de thermische cycler.Voor fluorescentie beeldvorming van het geëmulgeerde monster, breng de PCR-emulsie in een 50-micrometer diepe borosilicaat capillaire buis met een rechthoekig profiel, om de opstelling van de druppels in een dicht verpakte monolaag voor beeldvorming mogelijk te maken. Na het bevestigen en afdichten van de haarvaten op een microscoopdia, laadt u de glijbaan op het podium van de omgekeerde microscoop. En in de microscoop imaging software, selecteer verwerven en live snel, om real-time camera acquisitie te starten.Bekijk vervolgens het monster onder helder veld en fluorescentiemicroscopie. Na druppelgeneratie en thermische fietsen kunnen de druppels worden geïntroduceerd in een glazen capillair met een breedte van één millimeter en een hoogte van 50 micrometer. Om een monolaagverdeling van de druppels te verkrijgen die ideaal is voor het verwerven van fluorescentiebeelden, kunnen beelden vervolgens voor elke golflengte worden opgenomen.Na beeldanalyse kan de fluorescentieintensiteit van alle druppels in hun respectievelijke fluoroforen worden uitgezet om de drempel van de positieve en negatieve druppels vast te stellen. Na identificatie en telling kunnen de kopieën per druppelwaarden worden berekend en kan het percentage CD3+T-cellen en CD4+25+regulerende T-cellen worden bepaald op basis van respectievelijk de gemethyleerde CD3Z- en FOXP3-kopieën, met betrekking tot de kopieën per druppel van de totale cellen of C-less-gen. De procentuele waarden kunnen vervolgens worden vergeleken met die verkregen door middel van immunofluorescentie beeldvorming met behulp van de juiste antilichamen.Ik denk dat de emulsie stabiliteit van de druppel generatie door middel van de thermische fietsen en de laatste druppel imaging stappen is cruciaal voor het verkrijgen van nauwkeurige, betrouwbare en reproduceerbare kwantificering resultaten. MD PCR-aanpassing door middel van op maat gemaakte PCR-mixformulering kan worden gebruikt voor een aantal toepassingen, waaronder kankeronderzoek, diagnose van infectieziekten en analyses op het niveau van één cel.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescentie herstel na het samenvoegen van een druppel op de twee-dimensionale Verspreiding van een Phospholipid monolaag Meet

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Magnetische levitatie In combinatie met Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimalisatie van een Multiplex RNA gebaseerde expressie-Assay met behulp van borst kanker archiefmateriaal

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors om te detecteren Protease activiteit In Vivo Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...