Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Les auteurs reconnaissent l’appui financier du Conseil national de recherches du Canada.

Toutes les expériences réalisées dans le domaine de cette étude portant sur des échantillons humains ont été approuvées par le Comité d’éthique du CNRC et ont été réalisées conformément aux politiques du CNRC régissant les sujets humains qui suivent les lignes directrices de recherche applicables et qui sont conformes aux lois du Québec, au Canada.
1. Préparation cellulaire
<ol><li>Décongeler immédiatement les cellules mononucléaires périphériques humaines congelées...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

Le protocole et les méthodes expérimentaux présentés permettent le mdPCR interne à l’aide d’un générateur de gouttelettes TPE fabriqué, d’un cycleur thermique et d’un microscope à fluorescence. L’appareil fabriqué utilisant le TPE doux au collage TPE offre des propriétés de surface hydrophobes qui sont uniformes sur tous les murs du canal, de sorte que le dispositif final ne nécessite aucun traitement de surface pour une utilisation ultérieure comme générateur de gouttelettes. Ce matériel a ét...

L’analyse de la composition des globules blancs (CWB) est l’un des tests de laboratoire les plus fréquemment demandés dans le diagnostic hématologique. Le nombre différentiel de leucocytes sert d’indicateur pour un spectre de maladies comprenant l’infection, l’inflammation, l’anémie, et la leucémie, et est sous l’étude en tant que biomarqueur pronostique tôt pour plusieurs autres conditions aussi bien. L’étalon-or dans le sous-typage WBC implique l’immunostaining et/ou la cytométrie de flux qui exigent des anticorps fluorescents coûteux et sujets à l’instabilité et sont souvent fortement dépendants de la compétence de l’opérateur dans la préparation de l’échantillon. En outre, cette méthode ne s’applique qu’aux échantillons de sang frais, de sorte que les échantillons ne peuvent pas être congelés pour l’expédition ou l’analyse ultérieure.
Les marqueurs épigénétiques ont récemment émergé comme de puissants outils d’analyse pour l’étude des variations phénotypiques. Par la suite, il a été démontré que les populations de leucocytes humains avaient des modèles de méthylation de l’ADN de lignée cellulaire qui permettent la caractérisation précise des sous-ensembles WBC. Le sous-texte basé sur des marqueurs épigénétiques offre une alternative prometteuse qui ne dépend pas de la collecte d’échantillons de sang frais ou d’anticorps coûteux et peut être exploité comme biomarqueur pour l’apparition de la maladie et la susceptibilité1,2,3,4,5.
Des études à l’échelle du génome ont été réalisées pour une cartographie approfondie des régions spécifiques méthylées riches en CG dans le génome (îles CpG) dans des sous-types de leucocytes afin d’identifier les marqueurs épigénétiques candidats spécifiques aux sous-types de leucocytes. Des protocoles PCR ont été développés en raison de cette raison pour les régions de gènes méthylés, par exemple, CD3Z et FOXP3, correspondant à CD3+ T-Cells et CD4+ CD25+ T-Cells régulateurs (T-Regs), respectivement. Wiencke et coll. ont démontré l’utilité de la gouttelette duplex PCR pour le sous-typage épigénétique des lymphocytes T, donnant des résultats qui sont fortement corrélés avec l’analyse de tri cellulaire activée par flux (FACS)6. Cette méthode d’analyse génétique quantitative repose sur la partition des molécules d’acide nucléique de modèle et des réactifs PCR en milliers de gouttelettes discrètes, définies de façon volumétrique et sous-nanolitres contenant zéro, une ou plusieurs copies d’acide nucléique cible, à l’aide d’émulsions d’eau dans l’huile activées par microfluidiques7,8. L’amplification du PCR est effectuée dans chaque gouttelette individuelle et l’intensité de fluorescence du point d’évaluation de chaque gouttelette est mesurée, ce qui permet une quantification absolue des cibles présentes dans l’échantillon. Droplet PCR a été établi pour être plus précis, précis, et techniquement plus simple que qPCR standard, ce qui en fait une méthode plus favorable à base de méthylation de l’ADN pour l’évaluation clinique des lymphocytes T. Bien qu’une méthodologie de sous-tage émerge rapidement, l’analyse épigénétique multiplexée pour sonder pour diverses régions méthylées de CpG manque simultanément. Ceci est nécessaire pour les comptes différentiels de leucocytes de routine.
Ici, un dispositif microfluidique de gouttelette thermoplastique d’élastomère (TPE) est présenté et employé pour la mélilation spécifique à la gouttelette multiplexe PCR (mdPCR). La technologie a été utilisée pour délimiter des sous-types spécifiques de leucocytes, CD3+ T-Cells et CD4+ CD25+ T-Regs, basés sur des modèles de méthylation de l’ADN de lignée cellulaire, c’est-à-dire la variation épigénétique des régions CD3Z et FOXP3 CpG, respectivement. Un protocole détaillé pour l’extraction de l’ADN, la conversion de bisulfite et le mdPCR est décrit de concert avec une méthode de fabrication pour un dispositif de génération de gouttelettes de TPE. Les résultats représentatifs de la méthode sont comparés à ceux de la coloration d’immunofluorescence soulignant l’utilité de l’approche proposée.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

Un flux de travail de PCR de gouttelette multiplexe (mdPCR) et un protocole détaillé pour déterminer le nombre différentiel de globules blancs épigénétiques (WBC) sont décrits, ainsi qu’un dispositif thermoplastique de génération de gouttelettes d’élastomère (TPE). Les marqueurs épigénétiques sont utilisés pour le sous-typage WBC qui est d’une valeur pronostique importante dans différentes maladies. Ceci est réalisé par la quantification des modèles de méthylation de l’ADN de régions spécifiques riches en CG dans le génome (CpG loci). Dans cet article, l’ADN traité en bisulfite provenant de cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) est encapsulé dans des gouttelettes avec des réactifs mdPCR, y compris des amorces et des sondes fluorescentes d’hydrolyse spécifiques aux loci cpg qui sont en corrélation avec les sous-populations WBC. L’approche multiplexe permet l’interrogatoire de nombreux loci CpG sans avoir besoin de réactions mdPCR séparées, permettant une détermination paramétrique plus précise des sous-populations WBC à l’aide de l’analyse épigénétique des sites de méthylation. Cette quantification précise peut être étendue à différentes applications et met en évidence les avantages pour le diagnostic clinique et le pronostic suivant.

Le générateur de gouttelettes microfluidiques à base de TPE a été fabriqué à l’aide du protocole décrit comme indiqué à la figure 1. Un masque de transparence a été utilisé en photolithographie pour obtenir le silicium (Si) maître. La lithographie douce a été exécutée pour obtenir une réplique inverse de PDMS du maître de Si qui a ensuite été employée pour fabriquer le moule époxy. Le précurseur d’époxy a été versé sur le PDMS et guéri pour le crosslink et l...

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Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Les marqueurs épigénétiques sont utilisés pour le sous-tétrage des globules blancs (WBC) par la quantification des modèles de méthylation de l’ADN. Ce protocole présente une méthode de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette multiplexe (mdPCR) utilisant un dispositif microfluidique thermoplastique d’élastomère (TPE) pour la génération de gouttelettes permettant une quantification cible précise et multiplexe spécifique à la méthylation des nombres différentiels WBC.

Méthylation Spécifique Multiplex Droplet PCR à l’aide de polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Ce protocole présente un flux de travail flexible de PCR de gouttelette de multiplex qui permet le comptage différentiel précis de leukocyte basé sur des marqueurs épigénétiques de méthylation. Cette flexibilité peut faciliter la traduction du mdPCR vers l’utilisation clinique. Cette méthode fournit des résultats qui interrogent étroitement ceux obtenus en utilisant des méthodes de coloration immunofluorescente.Cependant, contrairement à la coloration immunofluorescente, cette méthode ne nécessite pas d’échantillons de sang frais ou d’anticorps coûteux. Dans les diagnostics hématologiques, le leucocyte différentiel peut servir d’indicateurs pour un spectre de maladies, y compris l’infection, l’inflammation, l’anémie et la leucémie, et est considéré comme un biomarqueur pronostique tôt de cancer. Christina Nassif, agente technique de notre équipe au Centre de recherche sur les dispositifs médicaux du CNRC, fera la démonstration de l’intervention avec Abdelrahman Elmanzalawy.Commencez par mélanger soigneusement 20 microlitres de protéine kinase K et 400 microlitres de tampon liant de lyse contenant des perles magnétiques avec les cellules mononucléaires périphériques humaines fraîchement décongelées de sang dans 100 microlitres de PBS. Après une incubation de cinq minutes à température ambiante, placer le tube sur une grille magnétique pendant une à deux minutes avant d’enlever le surnatant. Une fois le tube retiré de l’aimant, suspendez à nouveau le complexe de perles d’ADN dans 600 microlitres de tampon de lavage pour enlever les perles non spécifiquement liées.Remettre le tube sur l’aimant pour permettre l’enlèvement du supernatant, avant de laver les cellules dans 600 microlitres de tampon de lavage deux comme vient de le démontrer. Après avoir enlevé le supernatant, laissez le tube sécher à l’air libre sur l’aimant pendant une minute avant d’ajouter 100 microlitres de tampon d’élitution au tube avec un mélange complet. Ensuite, placez le tube sur la grille magnétique pendant une à deux minutes pour séparer les perles magnétiques de l’ADN mentionné, et transférez la solution d’ADN purifié à un nouveau tube.Pour la conversion de bisulfite de l’ADN purifié, transférez 20 microlitres de l’échantillon d’ADN mentionné à un tube PCR, et ajoutez 130 microlitres de réaccent de conversion au tube. Après un mélange approfondi, faites tourner brièvement le contenu du tube et amplifiez l’ADN sur un cycleur thermique. À la fin du cycle, ajouter 600 microlitres de tampon liant à une colonne de chromatographie iriontique placée dans un tube de collecte, et ajouter l’ADN à la colonne.Inverser le tube plusieurs fois pour mélanger, et centrifugeuse pendant 30 secondes à pleine vitesse. Jetez le flux collecté à travers, et ajouter 100 microlitres de tampon de lavage à la colonne. Centrifugez la colonne et jetez à nouveau le flow-through comme démontré.Ajouter 200 microlitres de tampon de désulfonation à la colonne pendant une incubation de 15 à 20 minutes à température ambiante, avant de centrifuger l’échantillon et de jeter le débit tel que démontré. Ensuite, lavez la colonne deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage par lavage. Après le deuxième lavage, transférer la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre et ajouter 100 microlitres d’eau de qualité PCR à la membrane de la colonne.Ensuite, élitez l’ADN par centrifugation de la colonne pendant une minute à pleine vitesse. Pour la génération de gouttelettes, mélangez un microlitre d’ADN converti à la bisulfite avec un mélange maître de sonde fraîchement préparé dans un tube PCR, et recueillez l’échantillon avec une brève centrifugation. Utilisez des raccords de pointe pour relier les tubes fluidiques jetables à deux seringues en verre de précision de 250 microlitres.Et pré-remplir une seringue en verre de précision avec 250 microlitres d’huile porteuse contenant 5% de surfactant flouro, et une seringue en verre de précision avec 50 microlitres d’huile porteuse. Lorsque les deux seringues ont été chargées, chargez 100 microlitres du mélange PCR dans la seringue de l’huile du transporteur et placez un dispositif microfluidique de gouttelette sur la scène d’un microscope à lumière verticale équipé d’une caméra à grande vitesse. Pour l’observation et l’enregistrement de la formation des gouttelettes en temps réel, placez les seringues préfillées sur une pompe à seringues programmable, et utilisez l’union de pointe avec des raccords pour relier le tube des seringues au tube des canaux d’entrée respectifs du dispositif microfluidique de gouttelette.Placez le tube de la sortie du générateur de gouttelettes à l’intérieur d’un tube PCR de 0,5 millilitre et ajustez le débit de la pompe à seringues à deux microlitres par minute, afin de permettre à la taille de la gouttelette de se stabiliser avant de recueillir l’émulsion qui en résulte. Recueillir lentement et soigneusement l’émulsion du haut du tube, et transférer 75 microlitres de la solution à un tube PCR de 200 microlitres pour le cycle thermique. Ensuite, confirmez que la teneur en huile dans le tube PCR correspond étroitement au volume de la phase dispersée, pour empêcher la coalescence des gouttelettes pendant le cycle thermique, et placez le tube de 200 microlitres dans le cycleur thermique.Pour l’imagerie par fluorescence de l’échantillon émulsionné, transférez l’émulsion PCR dans un tube capillaire borosilicate profond de 50 micromètres avec un profil rectangulaire, afin de permettre l’arrangement des gouttelettes dans un monocouche emballé près pour l’imagerie. Après avoir fixé et scellé les capillaires sur une lame de microscope, chargez la lame sur la scène du microscope inversé. Et dans le logiciel d’imagerie au microscope, sélectionnez acquérir et vivre rapidement, pour commencer l’acquisition de caméras en temps réel.Ensuite, observez l’échantillon sous un champ lumineux et une microscopie par fluorescence. Après la production de gouttelettes et le cycle thermique, les gouttelettes peuvent être introduites dans un capillaire en verre d’une largeur d’un millimètre et d’une hauteur de 50 micromètres. Pour obtenir une distribution monocouche des gouttelettes idéale pour l’acquisition d’images de fluorescence, des images peuvent ensuite être enregistrées pour chaque longueur d’onde.Après analyse d’image, l’intensité de fluorescence de toutes les gouttelettes dans leurs fluorophores respectifs peut être tracée pour établir le seuil des gouttelettes positives et négatives. Après identification et comptage, les copies par gouttelette peuvent être calculées, et le pourcentage de lymphocytes T CD3+, et de lymphocytes T CD4+25+réglementaires peut être déterminé en fonction des copies méthylés de CD3Z et foxp3 respectivement, en ce qui concerne les copies par gouttelette des cellules totales ou du gène sans C. Les valeurs en pourcentage peuvent ensuite être comparées à celles obtenues par imagerie par immunofluorescence à l’aide des anticorps appropriés.Je pense que la stabilité de l’émulsion de la génération des gouttelettes à travers le cycle thermique et les étapes finales d’imagerie gouttelette est cruciale pour obtenir des résultats de quantification précis, fiables et reproductibles. La personnalisation du PCR MD grâce à une formulation de mélange PCR sur mesure peut être utilisée pour un certain nombre d’applications, y compris la recherche sur le cancer, le diagnostic des maladies infectieuses et l’analyse au niveau d’une seule cellule.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Haute profilage de microARN Débit: Multiplex Optimisé qRT-PCR à l&#39;échelle nanolitres sur l&#39;IFC de Fluidigm ArrayTM dynamique

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Recherche

Bio-ingénierie

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Récupération de fluorescence après Fusionner une Droplet mesurer la Diffusion bidimensionnelle d&#39;une monocouche de phospholipides

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

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Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Une approche fondée sur les gouttelettes de microfluidique et microsphères-PCR Amplification d’ADN monocaténaire Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nano-capteurs pour détecter l’activité protéase In Vivo pour le diagnostic non invasif

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...