Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch den National Research Council of Canada.

Alle Experimente, die in dieser Studie mit menschlichen Proben durchgeführt wurden, wurden vom NRC Ethics Board genehmigt und wurden gemäß der NRC-Politik für menschliche Probanden durchgeführt, die den geltenden Forschungsrichtlinien folgen und den Gesetzen in Québec, Kanada, entsprechen.
1. Zellvorbereitung
<ol><li>Die gefrorenen menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) sofort auftauen, indem Sie das Kryovial in einem Wasserbad bei 37 °C für 5 min platzieren.</li>
...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

Das vorgestellte experimentelle Protokoll und die vorgestellten Methoden ermöglichen die hauseigene mdPCR mit einem hergestellten TPE-Tröpfchengenerator, einem thermischen Cycler und einem Fluoreszenzmikroskop. Das hergestellte Gerät mit weicher TPE-zu-TPE-Bindung bietet hydrophobe Oberflächeneigenschaften, die über alle Kanalwände gleichmäßig sind, so dass das Endgerät keine Oberflächenbehandlung für die spätere Verwendung als Tröpfchengenerator erfordert. Dieses Material wurde routinemäßig in Point-of-Ca...

Die Analyse der Zusammensetzung weißer Blutkörperchen (WBCs) gehört zu den am häufigsten nachgefragten Labortests in der hämatologischen Diagnostik. Differential-Leukozyten-Zahl dient als Indikator für ein Spektrum von Krankheiten einschließlich Infektion, Entzündung, Anämie, und Leukämie, und wird als frühe prognostische Biomarker für mehrere andere Bedingungen sowie untersucht. Der Goldstandard in der WBC-Subtypisierung beinhaltet Immunfärbung und/oder Durchflusszytometrie, die beide kostspielige, instabil-anfällige fluoreszierende Antikörper erfordern und oft stark von der Befähigung des Bedieners in der Probenvorbereitung abhängig sind. Darüber hinaus gilt diese Methode nur für frische Blutproben, so dass die Proben nicht für den Versand oder die spätere Analyse eingefroren werden können.
Epigenetische Marker haben sich in letzter Zeit als leistungsfähige Analysewerkzeuge für die Untersuchung von phänotypischen Variationen herausgestellt. In der Folge wurde gezeigt, dass menschliche Leukozytenpopulationen DNA-Methylierungsmuster für Zelllinien aufweisen, die eine präzise Charakterisierung von WBC-Teilmengen ermöglichen. Subtypisierung auf Basis epigenetischer Marker bietet eine vielversprechende Alternative, die nicht von der Entnahme von frischer Blutprobe oder teuren Antikörpern abhängt und als Biomarker für Krankheitsbeginn und Anfälligkeit1,2,3,4,5" genutzt werden kann.
Genomweite Studien wurden für die umfassende Kartierung methylierter spezifischer CG-reicher Regionen im Genom (CpG-Inseln) in Leukozytensubtypen durchgeführt, um epigenetische Kandidatenmarker zu identifizieren, die für Leukozytensubtypen spezifisch sind. PCR-Protokolle wurden aus diesem Grund für methylierte Genregionen entwickelt, z.B. CD3Z und FOXP3, entsprechend CD3+ T-Cells und CD4+ CD25+ Regulatory T-Cells (T-Regs). Wiencke et al. haben die Nützlichkeit der Duplex-Tropfen-PCR für die epigenetische Subtypisierung von T-Zellen nachgewiesen und ergebnissegebracht, die in hohem Maße mit der durchflussaktivierten Zellsortierung (FACS) Korpusanalyse korrelieren6. Diese quantitative genetische Analysemethode beruht auf der Aufteilung der Schablonennukleinsäuremoleküle und PCR-Reagenzien in Tausende von diskreten, volumetrisch definierten Tröpfchen mit Null, einer oder mehreren Zielnukleinsäurekopien, mit Wasser-in-Öl-Emulsionen, die durch Mikrofluidika aktiviert werden7,8. Die PCR-Verstärkung wird in jedem einzelnen Tröpfchen durchgeführt und die Endpunktfluoreszenzintensität jedes Tröpfchens wird gemessen, so dass eine absolute Quantifizierung der in der Probe vorhandenen Ziele möglich ist. Droplet PCR wurde etabliert, um präziser, genauer und technisch einfacher als Standard qPCR zu sein, was es zu einer günstigeren DNA-Methylierungs-basierten Methode für die klinische Bewertung von T-Cells macht. Obwohl eine sich rasch entwickelnde Subtypisierungsmethode fehlt, fehlt es an multiplexed epigenetischen Analysen, um verschiedene methylierte CpG-Regionen gleichzeitig zu untersuchen. Dies ist für routinemäßige Leukozytendifferenzzählungen notwendig.
Hierbei wird ein thermoplastisches Elastomer (TPE) Tröpfchen-Mikrofluid-Gerät vorgestellt und für methylierungsspezifische Multiplex-Tröpfchen-PCR (mdPCR) eingesetzt. Die Technologie wurde verwendet, um spezifische Leukozyten-Subtypen, CD3+ T-Cells und CD4+ CD25+ T-Regs, basierend auf Zelllinien-DNA-Methylierungsmustern, d.h. epigenetischen Variationen von CD3Z- bzw. FOXP3 CpG-Regionen, zu definieren. Ein detailliertes Protokoll zur DNA-Extraktion, Bisulfitumwandlung und mdPCR wird in Abstimmung mit einer Herstellungsmethode für ein TPE-Tröpfchenerzeugungsgerät beschrieben. Repräsentative Ergebnisse der Methode werden mit denen der Immunfluoreszenzfärbung verglichen, die den Nutzen des vorgeschlagenen Ansatzes unterstreicht.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

Ein Multiplex-Droplet-PCR-Workflow (mdPCR) und ein detailliertes Protokoll zur Bestimmung der epigenetischen Anzahl von weißen Blutkörperchen (WBC) werden zusammen mit einem thermoplastischen Elastomer (TPE) mikrofluidischen Tröpfchenerzeugungsgerät beschrieben. Epigenetische Marker werden für die WBC-Subtypisierung verwendet, die bei verschiedenen Krankheiten von wichtigem prognostischen Wert ist. Dies wird durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern bestimmter CG-reicher Regionen im Genom (CpG loci) erreicht. In diesem Beitrag wird bisulfitbehandelte DNA aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) in Tröpfchen mit mdPCR-Reagenzien, einschließlich Primern und hydrolysefluoreszierenden Sonden, die speziell für CpG-Loci sind, die mit WBC-Subpopulationen korrelieren, eingekapselt. Der Multiplex-Ansatz ermöglicht die Abfrage vieler CpG-Loci ohne separate mdPCR-Reaktionen, was eine genauere parametrische Bestimmung von WBC-Subpopulationen mithilfe epigenetischer Analysen von Methylierungsstellen ermöglicht. Diese präzise Quantifizierung kann auf verschiedene Anwendungen ausgedehnt werden und hebt die Vorteile für die klinische Diagnose und die anschließende Prognose hervor.

Das Mikrofluid-Tröpfchengeneratorgerät tPE wurde mit dem beschriebenen Protokoll hergestellt, wie in Abbildung 1dargestellt. Eine Transparenzmaske wurde in der Photolithographie verwendet, um Silizium (Si) Master zu erhalten. Weiche Lithographie wurde durchgeführt, um eine inverse PDMS-Replik des Si-Meisters zu erhalten, die dann verwendet wurde, um die Epoxidform herzustellen. Epoxid-Vorläufer wurde auf das PDMS gegossen und zu Vernetzung und Aushärten ausgehärtet. Diese Form, die die...

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Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Epigenetische Marker werden für die Untertypisierung von weißen Blutkörperchen (WBC) durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern verwendet. Dieses Protokoll stellt ein Multiplex-Droplet-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (mdPCR) unter Verwendung eines thermoplastischen Elastomer(TPE)-basierten mikrofluidischen Geräts zur Tröpfchenerzeugung dar, das eine präzise und Multiplexmethylierungsspezifische Zielquantifizierung von WBC-Differentialzählungen ermöglicht.

Methylierung spezifische Multiplex Droplet PCR mit Polymer Droplet Generator Gerät für die hämatologische Diagnostik

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Dieses Protokoll stellt einen flexiblen Multiplex-Tröpfchen-PCR-Workflow dar, der eine präzise Differential-Leukozytenzählung auf DerGrundlage epigenetischer Methylierungsmarker ermöglicht. Diese Flexibilität kann die Übersetzung von mdPCR in die klinische Anwendung erleichtern. Diese Methode liefert Ergebnisse, die mit immunfluoreszierenden Färbemethoden genau abgefragt werden.Im Gegensatz zur immunfluoreszenten Färbung erfordert diese Methode jedoch keine frischen Blutproben oder kostspieligen Antikörper. In der hämatologischen Diagnostik kann Differential-Leukozyten als Indikatoren für ein Spektrum von Krankheiten dienen, einschließlich Infektionen, Entzündungen, Anämie und Leukämie, und wird als ein früher prognostischer Krebs-Biomarker betrachtet. Die Demonstration des Verfahrens mit Abdelrahman Elmanzalawy wird Christina Nassif, eine technische Mitarbeiterin unseres Teams am NRC Medical Device Research Centre, zeigen.Beginnen Sie damit, 20 Mikroliter Proteinkinase K und 400 Mikroliter Lysebindungspuffer mit magnetischen Perlen mit frisch aufgetauten menschlichen peripheren Mononuklezellen in 100 Mikroliter PBS gründlich zu mischen. Legen Sie das Rohr nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur ein bis zwei Minuten auf ein Magnetischer Rack, bevor Sie den Überstand entfernen. Wenn das Rohr vom Magneten entfernt wird, setzen Sie den DNA-Perlenkomplex in 600 Mikroliter Waschpuffer wieder auf, um nicht spezifisch gebundene Perlen zu entfernen.Legen Sie das Rohr wieder auf den Magneten, um die Entfernung des Überstandes zu ermöglichen, bevor Sie die Zellen in 600 Mikroliter Waschpuffer zwei waschen, wie gerade gezeigt. Nach dem Entfernen des Überstandes lassen Sie das Rohr eine Minute lang lufttrocknen, bevor Sie dem Rohr 100 Mikroliter Elutionspuffer mit gründlicher Durchmischung hinzufügen. Legen Sie dann die Röhre für ein bis zwei Minuten auf das magnetische Rack, um die magnetischen Perlen von der angespielten DNA zu trennen, und übertragen Sie die gereinigte DNA-Lösung in eine neue Röhre.Für die Bisulfitumwandlung der gereinigten DNA 20 Mikroliter der angespielten DNA-Probe in ein PCR-Rohr übertragen und 130 Mikroliter Umwandlungsreagenz in das Rohr geben. Nach gründlichem Mischen den Rohrinhalt kurz verdrehen und die DNA auf einem thermischen Cycler verstärken. Fügen Sie am Ende des Zyklus 600 Mikroliter Bindungspuffer zu einer Ionenchromatographie-Säule hinzu, die in einem Sammelrohr platziert ist, und fügen Sie die DNA zur Spalte hinzu.Invertieren Sie das Rohr mehrmals zu mischen, und Zentrifuge für 30 Sekunden bei voller Geschwindigkeit. Entsorgen Sie den gesammelten Durchfluss, und fügen Sie der Spalte 100 Mikroliter Waschpuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Säule und entsorgen Sie den Durchfluss erneut, wie gezeigt.Fügen Sie 200 Mikroliter Desulfonationspuffer für eine Inkubation von 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur in die Säule, bevor Sie die Probe zentrifugieren und den Durchfluss entsorgen, wie gezeigt. Als nächstes waschen Sie die Säule zweimal mit 200 Mikroliter Waschpuffer pro Wäsche. Nach der zweiten Wäsche die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Sammelrohr geben und 100 Mikroliter PCR-Wasser in die Membran der Säule geben.Dann elute die DNA durch Zentrifugieren der Säule für eine Minute bei voller Geschwindigkeit. Mischen Sie für die Tröpfchenerzeugung einen Mikroliter Bisulfit-konvertierte DNA mit frisch zubereitetem Sonden-Master-Mix in einem PCR-Rohr und sammeln Sie die Probe mit einer kurzen Zentrifugation. Verwenden Sie Spitzenarmaturen, um Einweg-Fluidrohre mit zwei Präzisionsglasspritzen mit 250 MikroliterVolumen zu verbinden.Und füllen Sie eine Präzisionsglasspritze mit 250 Mikroliter Trägeröl mit 5% Mehltensid und eine Präzisionsglasspritze mit 50 Mikroliter Trägeröl vor. Wenn beide Spritzen geladen sind, 100 Mikroliter der PCR-Mischung in die Spritze des Trägeröls laden und ein Tropfen-Mikrofluid-Gerät auf die Bühne eines aufrechten Lichtmikroskops legen, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera ausgestattet ist. Zur Beobachtung und Aufzeichnung der Tröpfchenbildung in Echtzeit legen Sie die Fertigspritzen auf eine programmierbare Spritzenpumpe und verwenden Sie Spitzenunion mit Armaturen, um die Schläuche der Spritzen mit den Schläuchen der jeweiligen Einlasskanäle des Tröpfchens zu verbinden.Legen Sie die Schläuche vom Auslass des Tröpfchengenerators auf die Innenseite eines 0,5 Milliliter PCR-Rohrs, und stellen Sie den Spritzenpumpendurchfluss auf zwei Mikroliter pro Minute ein, damit sich die Tröpfchengröße stabilisieren kann, bevor die resultierende Emulsion gesammelt wird. Sammeln Sie die Emulsion langsam und vorsichtig von der Oberseite des Rohres und übertragen Sie 75 Mikroliter der Lösung auf ein 200-Mikroliter-PCR-Rohr für den thermischen Zyklus. Bestätigen Sie dann, dass der Ölgehalt in der PCR-Röhre eng mit dem Volumen der dispergierten Phase übereinstimmt, um eine Koaleszenz der Tröpfchen während des thermischen Zyklus zu verhindern, und legen Sie das 200-Mikroliter-Rohr in den thermischen Cycler.Übertragen Sie die PCR-Emulsion zur Fluoreszenzbildgebung der emulgierten Probe in ein 50 Mikrometer tiefes Borosilikatkapillarrohr mit rechteckigem Profil, um die Anordnung der Tröpfchen in eine eng verpackte Monoschicht für die Bildgebung zu ermöglichen. Nach der Fixierung und Abdichtung der Kapillaren auf einem Mikroskopschlitten laden Sie den Schlitten auf die Bühne des invertierten Mikroskops. Und in der Mikroskop-Bildgebungssoftware wählen Sie acquire und live schnell, um Echtzeit-Kamera-Erfassung zu starten.Beobachten Sie dann die Probe unter Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie. Nach der Tröpfchenerzeugung und dem thermischen Radfahren können die Tröpfchen in eine Glaskapillare mit einer Breite von einem Millimeter und einer Höhe von 50 Mikrometern eingeführt werden. Um eine monolayer Verteilung der Tröpfchen zu erhalten, die ideal für die Fluoreszenzbildaufnahme ist, können dann Bilder für jede Wellenlänge aufgezeichnet werden.Nach der Bildanalyse kann die Fluoreszenzintensität aller Tröpfchen in ihren jeweiligen Fluorophoren dargestellt werden, um den Schwellenwert der positiven und negativen Tröpfchen zu bestimmen. Nach der Identifizierung und Zählung können die Kopien pro Tröpfchen ermittelt werden, und der Prozentsatz der CD3+T-Zellen und CD4+25+regulatorischen T-Zellen kann anhand der methylierten CD3Z- bzw. FOXP3-Kopien in Bezug auf die Kopien pro Tröpfchen der Gesamtenzellen oder des C-losen Gens bestimmt werden. Die Prozentwerte können dann mit denen verglichen werden, die durch Immunfluoreszenz-Bildgebung mit den entsprechenden Antikörpern erreicht werden.Ich denke, dass die Emulsionsstabilität von der Tröpfchenerzeugung durch die thermischen Zyklus- und finalen Tröpfchenbildschritte entscheidend ist, um präzise, zuverlässige und reproduzierbare Quantifizierungsergebnisse zu erhalten. MD PCR Anpassung durch maßgeschneiderte PCR-Mix-Formulierung kann für eine Reihe von Anwendungen einschließlich Krebsforschung, Infektionskrankheiten Diagnose und Analytik auf der Einzelzellebene verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Forschung

Biotechnik

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescence Recovery nach der Zusammenführung ein Droplet, um die zweidimensionale Diffusion eines Phospholipidschicht Messen

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

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Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

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Magnetic Levitation Gekoppelt mit tragbaren Imaging und Analyse für Krankheitsdiagnostik

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Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimierung eines Multiplex-RNA-basierten Ausdruck-Assays mit Brust-Krebs-Archivmaterial

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A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

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Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensoren Protease-Aktivität In Vivo für die nicht-invasive Diagnostik zu erkennen

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...