Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

המחברים מכירים בתמיכה כספית ממועצת המחקר הלאומית של קנדה.

כל הניסויים שבוצעו במחקר זה מעורבים דגימות אנושיות אושרו על ידי מועצת האתיקה של NRC ונעשה על פי המדיניות של NRC המסדיר נושאים אנושיים המצייתים להנחיות המחקר החלות ותואמת את החוקים ב Québec, קנדה.
1. הכנת תאים
<ol><li>להפשיר את תאי הדם ההיקפיים הקפואים (PBMCs) באופן מיידי על ידי הצבת cryovia...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

הפרוטוקול הניסיוני שהוצג ושיטות לאפשר mdPCR בתוך הבית באמצעות גנרטור טיפות TPE מפוברק, מחזור תרמי, מיקרוסקופ פלואורסציט. המכשיר המפוברק באמצעות TPE רך כדי TPE מליטה מאפשר מאפייני פני השטח הידרופוביים כי הם אחידים על פני כל קירות הערוץ, כך המכשיר הסופי אינו דורש כל טיפול פני השטח לשימוש הבא כמחול?...

ניתוח של הרכב תאי דם לבנים (WBCs) הוא בין בדיקות המעבדה הנפוצות ביותר באבחון המטולוגי. ספירת לוקוציט דיפרנציאלית משמשת כאינדיקטור לספקטרום של מחלות כולל זיהום, דלקת, אנמיה, לוקמיה, והוא נמצא תחת חקירה כסמן ביולוגי פרוגנוסטי מוקדם עבור מספר תנאים אחרים, כמו גם. תקן זהב ב-WBC subtyping כרוך בחיסונים ו/או ציתומיה זרימה ששניהם דורשים נוגדני פלורסנט יקרים, הנוטים לחוסר יציבות, ולעתים קרובות תלויים מאוד במיומנות המפעיל בהכנה לדוגמה. יתר על כן, שיטה זו ישימה לדגימות דם טריות בלבד, כך שלא ניתן להקפיא את הדגימות לצורך משלוח או ניתוח מאוחר יותר.
סמנים אפיגנטיים התגלו לאחרונה ככלים אנליטיים רבי עוצמה לחקר וריאציות פנוטיפיות. לאחר מכן, אוכלוסיות לוקוצייט אנושיות הראו שיש דפוסי מתילציה DNA lineage תא המאפשרים אפיון מדויק של ערכות משנה WBC. תת-ערך המבוסס על סמנים אפיגנטיים מספק אלטרנטיבה מבטיחה שאינו תלוי באיסוף דגימות דם טריות או נוגדנים יקרים, וניתן לנצלו כסמן ביולוגי לתחילת מחלותורגישות 1,,2,,3,,4,,5.
מחקרים גנומיים בוצעו עבור מיפוי נרחב של אזורים עשירים CG ספציפיים מתילציה בגנום (איי CpG) בתתי-סוגים של leukocyte כדי לזהות סמנים אפיגנטיים מועמד ספציפי תת סוגי לוקוצייט. פרוטוקולי PCR פותחו בשל סיבה זו עבור אזורי גנים מתילציה, למשל, CD3Z ו FOXP3, המתאימים CD3+ T-תאים ו- CD4+ CD25+ תאי T רגולטוריים (T-Regs), בהתאמה. Wiencke ואח ' הדגימו את השירות של PCR טיפות דופלקס עבור subtyping epigenetic של T-תאים, תוצאות מניבות כי מאוד לתאם עם זרימה מופעל תא מיון (FACS)ניתוח 6. שיטת ניתוח גנטי כמותי זה מסתמכת על חלוקה למחיצות מולקולות חומצה גרעין תבנית ריאגנטים PCR לאלפי דיסקרטי, מוגדר נפח, טיפות בגודל תת-nanoliter המכיל אפס, אחד או יותר עותקים חומצה גרעין היעד, באמצעות אמולסיות מים בשמן מופעל על ידי microfluidics7,8. ההגדלה PCR מתבצעת בתוך כל טיפה בודדת ועוצמת פלואורסצנטיות נקודת הקצה של כל טיפה נמדדת, ומאפשרת כימות מוחלטת של מטרות הנוכחיות בדגימה. Droplet PCR הוקמה כדי להיות מדויק יותר, מדויק, ומבחינה טכנית פשוט יותר מאשר qPCR סטנדרטי, מה שהופך אותו לשיטה נוחה יותר מבוססי מתילציה DNA להערכה קלינית של T-תאים. למרות מתודולוגיית תת-טיפוס המתפתחת במהירות, ניתוח אפיגנטי מרובה כדי לבדוק עבור אזורי CpG מתילציה שונים בו זמנית חסר. זה הכרחי לספירת דיפרנציאל לוקוצייט שגרתית.
בזאת, מכשיר מיקרו-נוזלים תרמופלסטי (TPE) טיפות טיפות מוצג ומועסק עבור מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR (mdPCR). הטכנולוגיה שימשה כדי לפרט סוגי משנה ספציפיים leukocyte, CD3+ T-תאים ו- CD4+ CD25+ T-Regs, בהתבסס על דפוסי מתילציה DNA של שושלת תאים, כלומר, וריאציה אפיגנטית של אזורי CD3Z ו FOXP3 CpG, בהתאמה. פרוטוקול מפורט עבור הפקת DNA, המרת בישולפיט ו- mdPCR מתואר בקונצרט עם שיטת ייצור עבור מכשיר דור טיפות TPE. התוצאות המייצגות של השיטה מושוות לאלה של כתמי חיסון המדגישים את התועלת של הגישה המוצעת.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

זרימת עבודה של PCR (mdPCR) של טיפות מרובות ופרוטוקול מפורט לקביעת ספירת תאי דם לבנים מבוססי אפיגנטיקה (WBC) מתוארת, יחד עם התקן ייצור טיפות מיקרופלויד (TPE) תרמופלסטי. סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תת-תחליף WBC שהוא בעל ערך פרוגנוסטי חשוב במחלות שונות. זה מושגת באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA של אזורים ספציפיים עשירים CG בגנום (CpG loci). בנייר זה, ביסובפיט שטופלו DNA מתאי דם היקפיים מונונוקולריים (PBMCs) הוא עטוף טיפות עם reagents mdPCR כולל פריימרים ובדיקות הידרוליזה פלורסנט ספציפי עבור CpG loci כי לתאם עם אוכלוסיות משנה WBC. גישת המולטיפלקס מאפשרת חקירה של CpG loci רבים ללא צורך בתגובות MDPCR נפרדות, המאפשרת קביעה פרמטרית מדויקת יותר של תת-אוכלוסיות WBC באמצעות ניתוח אפיגנטי של אתרי מתילציה. כימות מדויקת זו יכולה להיות מורחבת ליישומים שונים ומדגישה את היתרונות לאבחון קליני ופרוגנוזה עוקבות.

התקן מחולל טיפות microfluidic מבוסס TPE היה מפוברק באמצעות הפרוטוקול המתואר כפי המוצג איור 1. מסיכת שקיפות שימשה בפוטוליתוגרפיה כדי להשיג סיליקון (Si) מאסטר. ליתוגרפיה רכה בוצעה כדי להשיג עותק משוכפל PDMS הפוך של מאסטר Si אשר שימש לאחר מכן כדי לפברק את עובש אפוקסי. מבשר אפוקסי נשפך על PD...

Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תא דם לבן (WBC) תת-כמות באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA. פרוטוקול זה מציג שיטת תגובת שרשרת פולימראז טיפות טיפות כפוליות (mdPCR) באמצעות elastomer תרמופלסטי (TPE) מבוסס מיקרופלואידים התקן עבור יצירת droplet המאפשר דיוק ו- multiplex ספציפית מתילציה היעד כימות של ספירות דיפרנציאליות WBC.

מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR באמצעות התקן מחולל טיפות פולימר לאבחון המטולוגי

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה גמישה של PCR של טיפת מולטיפלקס המאפשרת ספירת לויקוציט דיפרנציאלית מדויקת המבוססת על סמני מתילציה אפיגנטיים. גמישות זו עשויה להקל על התרגום של mdPCR לשימוש קליני. שיטה זו מספקת תוצאות כי שאילתה הדוק לאלה שהושגו באמצעות שיטות מכתים immunofluorescent.שלא כמו כתמים immunofluorescent, עם זאת, שיטה זו אינה דורשת דגימות דם טריות או נוגדנים יקרים. באבחון המטולוגי, לויקוציט דיפרנציאלי יכול לשמש אינדיקטורים עבור ספקטרום של מחלות, כולל זיהום, דלקת, אנמיה ולוקמיה, והוא נחשב סמן ביולוגי פרוגנוסטי מוקדם. הפגנת ההליך עם עבד אלרחמן אלמנזלאווי תהיה כריסטינה נאסיף, קצינה טכנית מהצוות שלנו במרכז לחקר מכשור רפואי של NRC.התחל על ידי ערבוב יסודי 20 microliters של חלבון קינאז K ו 400 microliters של חיץ קשירה תזה המכיל חרוזים מגנטיים עם תאים חד-גרעיניים דם היקפיים אנושיים מופשרים טריים ב 100 microliters של PBS. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את הצינור על מתלה מגנטי במשך דקה עד שתי דקות לפני הסרת העל-טבעי. עם הצינור הוסר מן המגנט, להשעות מחדש את קומפלקס חרוזים DNA ב 600 microliters של חיץ לשטוף אחד כדי להסיר את כל חרוזים שאינם קשורים במיוחד.מניחים את הצינור בחזרה על המגנט כדי לאפשר הסרה של supernatant, לפני שטיפת התאים 600 microliters של חיץ לשטוף שני כפי שהודגם רק. לאחר הסרת העל-טבעי, אפשר לצינור להתייבש באוויר על המגנט למשך דקה אחת לפני הוספת 100 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון לצינור עם ערבוב יסודי. לאחר מכן, מניחים את הצינור על המדף המגנטי למשך שעה עד שתי דקות כדי להפריד את חרוזים מגנטיים מן ה-DNA רמז, ולהעביר את פתרון DNA מטוהרים לצינור חדש.להמרה ביסולפית של ה-DNA המטוהר, להעביר 20 microliters של דגימת DNA רמז לצינור PCR, ולהוסיף 130 microliters של reagent המרה לצינור. לאחר ערבוב יסודי, לזמן קצר לסובב את תכולת הצינור להגביר את ה-DNA על רוכב אופניים תרמי. בסוף המחזור, להוסיף 600 microliters של מאגר מחייב לעמודה כרומטוגרפיה יון להציב בצינור איסוף, ולהוסיף את ה-DNA לעמודה.להפוך את הצינור מספר פעמים לערבב, צנטריפוגה במשך 30 שניות במלוא המהירות. השלך את הזרימה שנאספה דרך, והוסף 100 microliters של מאגר לשטוף לעמודה. צנטריפוגה העמודה ולזרוק את הזרימה דרך שוב כפי שהוכח.הוסף 200 microliters של מאגר Desulfonation לעמודה עבור דגירה 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר, לפני צנטריפוגה המדגם והשליכת זרימה דרך כפי שהוכח. לאחר מכן, לשטוף את הטור פעמיים עם 200 microliters של חיץ לשטוף לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, להעביר את העמודה לצינור איסוף חדש 1.5 מיליליטר, ולהוסיף 100 microliters של מים כיתה PCR לממברנה של העמוד.לאחר מכן, לחמק ה-DNA על ידי צנטריפוגה של הטור במשך דקה אחת במלוא המהירות. עבור ייצור טיפות, יש לערבב מיקרוליטר אחד של דנ"א מומר ביסולפי עם תערובת ראשית של בדיקה שהוכנה זה לזה בצינור PCR, ולאסוף את הדגימה עם צנטריפוגה קצרה. השתמשו באביזרים שיא לחיבור צינורות נוזליים חד פעמיים לשני מזרקי זכוכית מדויקים בנפח 250 מיקרוליטר.ומלאו מראש מזרק זכוכית מדויק אחד עם 250 מיקרוליטרים של שמן נושא המכילים חומר שטח 5%flouro, ומזרק זכוכית מדויק אחד עם 50 מיקרוליטרים של שמן נושא. כאשר שני המזרקים נטענו, לטעון 100 microliters של PCR לערבב לתוך המזרק של שמן נושאת, ולה מניחים מכשיר microfluidic טיפה על הבמה של מיקרוסקופ אור זקוף מצויד במצלמה במהירות גבוהה. לתצפית והקלטה של היווצרות טיפות בזמן אמת, מניחים את המזרקים שמולאים מראש על משאבת מזרק ניתנת לתיוכנת, ולהשתמש באיחוד שיא עם אביזרים כדי לחבר את צינורות המזרקים לאקוסיבות של ערוצי המזרק המתאימים של המכשיר microfluidic טיפה.מניחים את הצינור מהשקע של גנרטור טיפה אל החלק הפנימי של צינור PCR 0.5 מיליליטר, ולהתאים את קצב זרימת משאבת המזרק לשני microliters לדקה, כדי לאפשר את גודל טיפה להתייצב לפני איסוף אמולסיה וכתוצאה מכך. לאט ובזהירות לאסוף את אמולסיה מהחלק העליון של הצינור, ולהעביר 75 microliters של הפתרון צינור PCR 200 microliter עבור רכיבה תרמית. לאחר מכן, לאשר כי תוכן השמן בצינור PCR תואם באופן הדוק את נפח השלב המפוזר, כדי למנוע התמזגות של טיפות במהלך רכיבה תרמית, ולמקם את הצינור 200 microliter לתוך האופניים התרמיים.להדמיית פלואורסצנטיות של הדגימה הממולאת, העבר את אמולסיית ה- PCR לצינור נימי בורוסיליט עמוק של 50 מיקרומטר עם פרופיל מלבני, כדי לאפשר סידור של טיפות למונוליאר ארוז קרוב להדמיה. לאחר תיקון ואיטום נימים על מגלשת מיקרוסקופ, לטעון את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. ובתוכנות הדמיית מיקרוסקופ, בחר לרכוש ולחיות מהר, כדי להתחיל רכישת מצלמה בזמן אמת.לאחר מכן, יש להתבונן בדגימה תחת שדה בהיר ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר ייצור טיפות ורכיבה תרמית, ניתן להציג את ה טיפות לתוך נימי זכוכית עם רוחב של מילימטר אחד וגובה של 50 מיקרומטר. כדי להשיג התפלגות monolayer של טיפות כי הוא אידיאלי עבור רכישת תמונה פלואורסצנטי, תמונות אז ניתן להקליט עבור כל אורך גל.לאחר ניתוח תמונה, ניתן לתכנן את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל טיפות הפלואורופורים המתאימים שלהן כדי לקבוע את הסף של טיפות חיוביות ושליליות. לאחר זיהוי וספירה, ניתן לחשב את העותקים לכל ערכי droplet, ואת אחוז CD3 + T-תאים, ו CD4 +25 + תאי T רגולטוריים ניתן לקבוע בהתבסס על עותקי CD3Z ו FOXP3 מתילציה בהתאמה, ביחס עותקים לכל טיפה של התאים הכולל או גן C-less. לאחר מכן ניתן להשוות את ערכי האחוז לאלה המתקבלים באמצעות הדמיה immunofluorescence באמצעות הנוגדנים המתאימים.אני חושב שהיציבות של אמולסיה מדור הירידה דרך רכיבה תרמית וצעדי הדמיה סופיים של טיפות היא חיונית להשגת תוצאות כימות מדויקות, אמינות ותרבותיות. התאמה אישית של MD PCR באמצעות ניסוח תערובת PCR מותאם אישית יכולה לשמש עבור מספר יישומים כולל חקר הסרטן, אבחון מחלות זיהומיות וניתוח ברמת התא הבודד.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

ריחוף מגנטי יחד עם הדמיה ניידת וניתוח עבור אבחון מחלות

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

אופטימיזציה של וזמינותו הביטוי מבוסס-RNA מולטיפלקס באמצעות חומר ארכיוני של סרטן השד

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

גישה Microfluidic המבוססות על Droplet ו ננו-ספירה-PCR הגברה עבור חד גדילי DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors כדי לאתר פרוטאז פעילות In Vivo אבחון לא פולשנית

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...