Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del Consiglio Nazionale delle Ricerche del Canada.

Tutti gli esperimenti condotti in questo studio che hanno coinvolto campioni umani sono stati approvati dal Comitato Etico del NRC e sono stati fatti secondo le politiche del NRC che disciplinano i soggetti umani che seguono le linee guida di ricerca applicabili e sono conformi alle leggi del Québec, Canada.
1. Preparazione cellulare
<ol><li>Scongelare immediatamente le cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBFC) congelate mettendo il criovial in un bagno d'acqua a 37 gradi cent...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

Il protocollo e i metodi sperimentali presentati consentono di mdPCR interno utilizzando un generatore di goccioline TPE fabbricato, un ciclo termico e un microscopio a fluorescenza. Il dispositivo fabbricato utilizzando il legame morbido da TPE a TPE offre proprietà di superficie idrofobiche uniformi su tutte le pareti del canale, in modo che il dispositivo finale non richieda alcun trattamento superficiale per un uso successivo come generatore di goccioline. Questo materiale è stato regolarmente impiegato in piattafo...

L'analisi della composizione dei globuli bianchi (WBC) è tra i test di laboratorio più richiesti nella diagnostica ematologica. Il conteggio differenziale dei leucoc primi è un indicatore per uno spettro di malattie tra cui infezione, infiammazione, anemia e leucemia, ed è sotto indagine come biomarcatore prognostico precoce per diverse altre condizioni. Il Gold Standard nella sottotipizzazione WBC comporta l'immunostaining e/o la citometria di flusso che richiedono anticorpi fluorescenti costosi e soggetti a instabilità e sono spesso fortemente dipendenti dalla competenza dell'operatore nella preparazione del campione. Inoltre, questo metodo è applicabile solo ai campioni di sangue fresco, in modo che i campioni non possano essere congelati per la spedizione o per un'analisi successiva.
I marcatori epigenetici sono recentemente emersi come potenti strumenti analitici per lo studio delle variazioni fenotiptiche. Successivamente, è stato dimostrato che le popolazioni di leucocici umani hanno modelli di metilazione del DNA del lignaggio cellulare che consentono la caratterizzazione precisa dei sottoinsiemi WBC. La sottotipazione basata su marcatori epigenetici fornisce un'alternativa promettente che non dipende dalla raccolta di campioni di sangue fresco o da anticorpi costosi e può essere sfruttata come biomarcatore per l'insorgenza della malattia e la suscettibilità1,2,3,4,5.
Sono stati condotti studi a livello di genoma per un'ampia mappatura di regioni specifiche ricche di CG metilate nel genoma (isole CpG) in sottotipi di leucocideti per identificare marcatori epigenetici candidati specifici per i sottotipi di leucocide. I protocolli PCR sono stati sviluppati per questo motivo per le regioni geniche metilate, ad esempio CD3 e FOXP3, corrispondenti rispettivamente aCD3, cellule T eCD4, CD25, cellule T regolamentari (T-Regs).+ Wiencke et al. hanno dimostrato l'utilità di gocciolina duplex PCR per la sottotipazione epigenetica di T-Cells, producendo risultati che altamente correlati con l'analisi di ordinamento cellulare attivato dal flusso (FACS)6. Questo metodo di analisi genetica quantitativa si basa sulla partizionamento del modello di molecole di acido nucleico e reagenti PCR in migliaia di goccioline discrete, volumetricamente definite, di dimensioni sub-nanoliter contenenti zero, una o più copie di acido nucleico bersaglio, utilizzando emulsioni acqua-in-olio abilitate da microfluidica7,8. L'amplificazione PCR viene eseguita all'interno di ogni singola goccia e viene misurata l'intensità di fluorescenza del punto finale di ogni goccia, consentendo la quantificazione assoluta degli obiettivi presenti nel campione. Droplet PCR è stato stabilito per essere più preciso, preciso, e tecnicamente più semplice di qPCR standard, rendendolo un metodo più favorevole dna metilazione-based per la valutazione clinica delle cellule T. Sebbene manchi contemporaneamente una metodologia di sottotipazione in rapida crescita, l'analisi epigenetica multiplessa per sondare varie regioni CpG metilate. Ciò è necessario per i conteggi differenziali di leucocenza di routine.
In questo caso, un dispositivo microfluidico a goccia termoplastica elastomero (TPE) viene presentato e impiegato per la gocciolina multiplex PCR (mdPCR) specifica della metilazione. La tecnologia è stata utilizzata per delineare sottotipi specifici di leucocici,CD3 , T-Cells eCD4 , CD25 , T-Regs, sulla base di modelli di metilazione del DNA di linea cellulare, cioè, variazione epigenetica delle regioni CD3 e FOXP3 CpG, rispettivamente. Un protocollo dettagliato per l'estrazione del DNA, la conversione dei bisulfiti e mdPCR è descritto in concerto con un metodo di fabbricazione per un dispositivo di generazione di goccioline TPE. I risultati rappresentativi del metodo vengono confrontati con quelli della colorazione dell'immunofluorescenza evidenziando l'utilità dell'approccio proposto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

Viene descritto un flusso di lavoro PCR (mdPCR) a goccia multiplexed e un protocollo dettagliato per determinare il numero differenziale dei globuli bianchi a base epigenetica (WBC), insieme a un dispositivo di generazione di goccioline microfluidiche di elastimero termoplastico (TPE). Marcatori epigenetici sono utilizzati per la sottotipazione WBC che è di importante valore prognostico in diverse malattie. Ciò si ottiene attraverso la quantificazione dei modelli di metilazione del DNA di specifiche regioni ricche di CG nel genoma (CpG loci). In questo articolo, il DNA trattato con bisulfite da cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) è incapsulato in goccioline con reagenti mdPCR, tra cui primer e sonde fluorescenti idrolisi specifiche per i loci CpG che sono correlati alle sottopposizioni WBC. L'approccio multiplex consente l'interrogatorio di molti loci CpG senza la necessità di reazioni mdPCR separate, consentendo una determinazione parametrica più accurata delle sottoppole WBC utilizzando l'analisi epigenetica dei siti di metilazione. Questa quantificazione precisa può essere estesa a diverse applicazioni ed evidenzia i benefici per la diagnosi clinica e la successiva prognosi.

Il dispositivo generatore di goccioline microfluidiche basato su TPE è stato fabbricato utilizzando il protocollo descritto, come illustrato nella Figura 1. Una maschera di trasparenza è stata utilizzata nella fotolithografia per ottenere il maestro del silicio (Si). La litiografia morbida è stata eseguita per ottenere una replica PDMS inversa del maestro Si che è stata poi utilizzata per fabbricare lo stampo epossico. Il precursore dell'epossia è stato versato sul PDMS e curato per inc...

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Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Marcatori epigenetici sono utilizzati per sottotipi di globuli bianchi (WBC) attraverso la quantificazione dei modelli di metilazione del DNA. Questo protocollo presenta un metodo di reazione a catena di polimerasi a goccia multiplex (mdPCR) utilizzando un dispositivo microfluidometro termoplastico (TPE) per la generazione di droplet che consente una quantificazione mirata precisa e multiplex specifica della metilazione dei conteggi differenziali WBC.

Metilazione specifica Multiplex Droplet PCR utilizzando Polymer Droplet Generator Device per la diagnostica ematologica

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro PCR a goccia multiplex flessibile che consente un conteggio preciso dei leucociti differenziali basato su marcatori di metilazione epigenetica. Questa flessibilità può facilitare la traduzione di mdPCR verso l'uso clinico. Questo metodo fornisce risultati che interrogano attentamente quelli ottenuti utilizzando metodi di colorazione immunofluorescenti.A differenza della colorazione immunofluorescente, tuttavia, questo metodo non richiede campioni di sangue fresco o anticorpi costosi. Nella diagnostica ematologica, il leucocita differenziale può servire come indicatori per uno spettro di malattie, tra cui infezione, infiammazione, anemia e leucemia, ed è considerato come un biomarcatore precoce del cancro prognostico. A dimostrare la procedura con Abdelrahman Elmanzalawy sarà Christina Nassif, responsabile tecnico del nostro team presso il Medical Device Research Centre di NRC.Iniziare mescolando accuratamente 20 microlitri di protein chinasi K e 400 microlitri di tampone legante di lisi contenenti perline magnetiche con cellule mononucleari del sangue periferico umano appena scongelate in 100 microlitri di PBS. Dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, posizionare il tubo su un rack magnetico per uno o due minuti prima di rimuovere il supernatante. Con il tubo rimosso dal magnete, sospendere di nuovo il complesso di perline di DNA in 600 microlitri di tampone di lavaggio uno per rimuovere eventuali perline non specificamente legate.Riposizionare il tubo sul magnete per consentire la rimozione del supernatante, prima di lavare le celle in 600 microlitri di tampone di lavaggio due come appena dimostrato. Dopo aver rimosso il supernatante, lasciare asciugare il tubo all'aria sul magnete per un minuto prima di aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione al tubo con miscelazione accurata. Quindi, posizionare il tubo sul rack magnetico per uno o due minuti per separare le perline magnetiche dal DNA alluso e trasferire la soluzione di DNA purificato in un nuovo tubo.Per la conversione della bisolfito del DNA purificato, trasferire 20 microlitri del campione di DNA alluso in un tubo PCR e aggiungere 130 microlitri di reagente di conversione al tubo. Dopo un'accurata miscelazione, far girare brevemente il contenuto del tubo e amplificare il DNA su un ciclore termico. Alla fine del ciclo, aggiungere 600 microlitri di tampone legante a una colonna di cromatografia ionica posta in un tubo di raccolta e aggiungere il DNA alla colonna.Invertire il tubo più volte per mescolare e centrifugare per 30 secondi a tutta velocità. Scartare il flusso raccolto e aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio alla colonna. Centrifugare la colonna e scartare nuovamente il flusso come dimostrato.Aggiungere 200 microlitri di Desulfonation Buffer alla colonna per un'incubazione da 15 a 20 minuti a temperatura ambiente, prima di centrifugare il campione e scartare il flusso-through come dimostrato. Quindi, lavare la colonna due volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, trasferire la colonna su un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri e aggiungere 100 microlitri di acqua di grado PCR alla membrana della colonna.Quindi, elutare il DNA centrifugando la colonna per un minuto a tutta velocità. Per la generazione di goccioline, mescolare un microlitro di DNA convertito con bisolfito con un mix di master di sonda appena preparato in un tubo PCR e raccogliere il campione con una breve centrifugazione. Utilizzare raccordi di picco per collegare tubi fluidici usa e getta a due siringhe in vetro di precisione a volume da 250 microliter.E pre-riempire una siringa di vetro di precisione con 250 microlitri di olio vettore contenente il 5% di tensioattivi flouro e una siringa di vetro di precisione con 50 microlitri di olio vettore. Quando entrambe le siringhe sono state caricate, caricare 100 microlitri del PCR mescolare nella siringa dell'olio portante e posizionare un dispositivo microfluidico a goccia sullo stadio di un microscopio a luce verticale dotato di una telecamera ad alta velocità. Per l'osservazione e la registrazione della formazione di goccioline in tempo reale, posizionare le siringhe preriempita su una pompa di siringhe programmabile e utilizzare l'unione di picco con i raccordi per collegare il tubo delle siringhe al tubo dei rispettivi canali di ingresso del dispositivo microfluidico a goccia.Posizionare il tubo dall'uscita del generatore di goccioline all'interno di un tubo PCR da 0,5 millilitri e regolare la portata della pompa della siringa a due microlitri al minuto, per consentire alle dimensioni della goccia di stabilizzarsi prima di raccogliere l'emulsione risultante. Raccogliere lentamente e con cura l'emulsione dalla parte superiore del tubo e trasferire 75 microlitri della soluzione in un tubo PCR da 200 microlitri per il ciclo termico. Quindi, confermare che il contenuto di olio nel tubo PCR corrisponde strettamente al volume della fase dispersa, per evitare coalescenza delle goccioline durante il ciclo termico e posizionare il tubo da 200 microliter nel ciclore termico.Per l'imaging a fluorescenza del campione emulsionato, trasferire l'emulsione PCR in un tubo capillare borosilicato profondo 50 micrometri con un profilo rettangolare, per consentire la disposizione delle goccioline in un monostrato chiuso imballato per l'imaging. Dopo aver riparato e sigillato i capillari su uno scivolo del microscopio, caricare lo scivolo sullo stadio del microscopio invertito. E nel software di imaging al microscopio, selezionare acquisire e vivere velocemente, per avviare l'acquisizione della fotocamera in tempo reale.Quindi, osservare il campione sotto campo luminoso e microscopia a fluorescenza. Dopo la generazione di goccioline e il ciclo termico, le goccioline possono essere introdotte in un capillare di vetro con una larghezza di un millimetro e un'altezza di 50 micrometri. Per ottenere una distribuzione monostrato delle goccioline ideale per l'acquisizione di immagini a fluorescenza, le immagini possono quindi essere registrate per ogni lunghezza d'onda.Dopo l'analisi delle immagini, l'intensità di fluorescenza di tutte le goccioline nei rispettivi fluorofori può essere tracciata per stabilire la soglia delle goccioline positive e negative. Dopo l'identificazione e il conteggio, è possibile calcolare le copie per valori di goccioline e determinare la percentuale di cellule CD3+T e cd4+25+ cellule T regolatorie in base rispettivamente alle copie metilate cd3Z e FOXP3, rispetto alle copie per goccia delle cellule totali o del gene C-less. I valori percentuali possono quindi essere confrontati con quelli ottenuti attraverso l'imaging ad immunofluorescenza utilizzando gli anticorpi appropriati.Penso che la stabilità dell'emulsione dalla generazione di goccioline attraverso il ciclo termico e le fasi finali di imaging delle goccioline sia fondamentale per ottenere risultati di quantificazione precisi, affidabili e riproducibili. La personalizzazione md PCR attraverso una formulazione di mix PCR su misura può essere utilizzata per una serie di applicazioni tra cui la ricerca sul cancro, la diagnosi delle malattie infettive e l'analisi a livello di singola cellula.

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Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensori per rilevare attività della proteasi In Vivo per la diagnostica non invasiva

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...