Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
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저자는 캐나다 국립 연구위원회의 재정 지원을 인정합니다.

인간 샘플과 관련된 이 연구에서 수행된 모든 실험은 NRC 윤리 위원회의 승인을 받았으며, 관련 연구 지침을 따르고 캐나다 퀘벡의 법률을 준수하는 인간 과목을 지배하는 NRC의 정책에 따라 수행되었습니다.
1. 셀 준비
<ol><li>냉동 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 37°C의 수조에 5분 동안 배치하여 즉시 동결된 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 해동한다.</li>
	<li>극저온을 두 번 ?...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

제시된 실험 프로토콜 및 방법은 제조된 TPE 액적 발생기, 열 사이클러 및 형광 현미경을 사용하여 사내 mdPCR을 허용합니다. 소프트 TPE에서 TPE 접합에 소프트 TPE를 사용하는 제조 된 장치는 최종 장치가 물방울 발생기로 후속 사용하기 위해 표면 처리를 필요로하지 않도록 모든 채널 벽에 걸쳐 균일 한 소수성 표면 특성을 제공합니다. 이 물질은 정기적으로 높은 처리량,제조9,<...

백혈구 (WbCs) 조성물의 분석은 혈액학 진단에서 가장 자주 요청되는 실험실 테스트 중 하나입니다. 차동 백혈병 수는 감염, 염증, 빈혈 및 백혈병을 포함한 질병의 스펙트럼에 대한 지표역할을하며, 뿐만 아니라 여러 다른 조건에 대한 초기 예후 바이오 마커로 조사되고 있습니다. WBC 피타이핑의 금 본위제는 면역염색 및/또는 유동 세포측정을 수반하며, 이는 비용이 많이 드는 불안정하기 쉬운 형광 항체를 필요로 하며 종종 샘플 준비에 있어 작업자 의 숙련도에 크게 의존합니다. 더욱이, 이 방법은 선적 또는 나중에 분석을 위해 시료를 동결할 수 없도록 신선한 혈액 샘플에만 적용됩니다.
후성 유전학 마커는 최근에 현상변의 연구 를 위한 강력한 분석 공구로 나타났습니다. 그 후, 인간 백혈구 집단은 WBC 서브세트의 정확한 특성화를 허용하는 세포 계보 DNA 메틸화 패턴을 갖는 것으로 나타났다. 후성 유전학 마커에 기초한 형량은 신선한 혈액 샘플 수집 또는 고가의 항체에 의존하지 않는 유망한 대안을 제공하고 질병 발병 및 감수성1,,2,,3,,4,,5에대한 바이오마커로 악용될 수 있다.
유전체 전체 연구는 백혈구 하위 형에 있는 게놈 (CpG islands)에 있는 메틸화한 특정 CG 부유한 지구의 광대한 매핑을 위해 수행되었습니다 백혈구 하위 형에 특정한 후성 유전학 마커를 확인하기 위하여. PCR 프로토콜은 각각 CD3+ T 세포 및 CD4+ CD25+ 규제 T-셀 (T-Regs)에 대응하는 메틸화 유전자 영역(예: CD3Z 및 FOXP3)에 대한 이러한 이유로 개발되었습니다. Wiencke 등은 T 세포의 후성 유전학 적분화를 위한 듀플렉스 액적 PCR의 유용성을 입증하여 유동 활성화 세포 선별(FACS) 분석6과높은 상관관계를 갖는 결과를 산출하고 있다. 이러한 정량적 유전 분석 방법은미유체액7,,8에의해 활성화된 수유 에멀젼을 사용하여 0, 하나 이상의 표적 핵산 사본을 포함하는 수천 개의 이산, 체적 정의, 하위 나노리터 크기의 액적으로 템플릿 핵산 분자 및 PCR 시약을 분할하는 데 의존한다. PCR 증폭은 각 개별 액적 내에서 수행되며 각 액적의 끝점 형광 강도가 측정되어 샘플에 존재하는 표적의 절대적인 정량화를 허용합니다. 물방울 PCR은 표준 qPCR보다 더 정확하고 정확하며 기술적으로 더 간단하도록 설립되어 T 세포의 임상 평가를위한 DNA 메틸화 기반 방법이 더 유리하게 되었습니다. 급속히 떠오르는 하위 입력 방법론이지만, 다양한 메틸화 CpG 영역을 동시에 조사하기 위한 멀티플렉스 후성 유전학 분석이 부족합니다. 이것은 일상적인 백혈구 차동 수에 필요합니다.
본 명세서에서, 열가소성 탄성동체(TPE) 액적 미세유체 장치는 메틸화 특이적 멀티플렉스 액적 PCR(mdPCR)에 제시되고 사용된다. 이 기술은 특정 백혈구 하위 형, CD3+ T 세포 및 CD4+ CD25+ T-Regs를 묘사하는 데 사용되었으며, 셀 리니지 DNA 메틸화 패턴, 즉 CD3Z 및 FOXP3 CpG 영역의 후성 유전학 적 변이를 각각 기반으로합니다. DNA 추출, 양성환 변환 및 mdPCR에 대한 상세한 프로토콜은 TPE 액적 생성 장치에 대한 제조 방법과 함께 설명된다. 방법의 대표적인 결과는 제안된 접근법의 유용성을 강조하는 면역형광 염색의 것과 비교된다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

후성 유전학 기반 백혈구 (WBC) 차동 수를 결정하기위한 멀티플렉스 액적 PCR (mdPCR) 워크플로우 및 상세한 프로토콜이 열가소성 탄성 동선 (TPE) 미세 유체 액적 발생 장치와 함께 설명된다. 후성 유전학 마커는 다른 질병에 있는 중요한 예후 값의 WBC 분체에 사용됩니다. 이는 게놈(CpG loci)에서 특정 CG-풍부한 영역의 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 달성된다. 본 논문에서, 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서 양성환처리된 DNA는 WBC 하위 집단과 상관관계가 있는 CpG loci에 특정한 프라이머 및 가수분해 형광 프로브를 포함하는 mdPCR 시약으로 액적물에서 캡슐화된다. 멀티플렉스 접근법은 별도의 mdPCR 반응없이 많은 CpG loci의 심문을 허용하여 메틸화 부위의 후성 유전학 분석을 사용하여 WBC 하위 집단의 보다 정확한 파라메트릭 측정을 가능하게합니다. 이 정확한 정량화는 다른 응용 프로그램으로 확장될 수 있고 임상 진단 및 후속 예후를 위한 이점을 강조합니다.

TPE 기반 미세 유체 액적 발생기 장치는 도 1에도시된 바와 같이 기술된 프로토콜을 사용하여 제조되었다. 투명 도면은 실리콘(Si) 마스터를 얻기 위해 포토리소그래피에 사용되었습니다. 소프트 리소그래피는 에폭시 몰드를 제조하는 데 사용된 시 마스터의 역 PDMS 복제본을 얻기 위해 수행되었다. 에폭시 전구체는 PDMS에 부어 크로스 링크 및 경화경화되었다. Si 마스터의 정확...

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Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

후성 유전학 마커는 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 백혈구 (WBC) 과형을 위해 사용됩니다. 이 프로토콜은 WBC 차동 수의 정밀하고 멀티플렉스 메틸화 특이적 표적 정량화를 허용하는 방울 생성을 위한 열가소성 탄성동체(TPE) 기반 미세 유체 장치를 사용하여 멀티플렉스 액적 폴리머(mdPCR) 방법을 제시한다.

혈액학적 진단을 위한 폴리머 물방울 발생기 장치를 사용하여 메틸화 특정 멀티플렉스 물방울 PCR

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

이 프로토콜은 후생 유전학 메틸화 마커를 기반으로 정확한 차동 백혈구 계수를 허용하는 유연한 멀티플렉스 물방울 PCR 워크플로우를 제공합니다. 이러한 유연성은 임상 사용을 향한 mdPCR의 번역을 용이하게 할 수 있다. 이 방법은 면역 형광 염색 방법을 사용하여 얻은 사람들에게 밀접하게 쿼리하는 결과를 제공합니다.그러나 면역형성 염색과는 달리, 그러나, 이 방법은 신선한 혈액 견본 또는 비용이 많이 드는 항체를 요구하지 않습니다. 혈액학적 진단에서 차동 백혈구는 감염, 염증, 빈혈 및 백혈병을 포함한 다양한 질병의 지표로 작용할 수 있으며 조기 예후암 바이오마커로 간주되고 있습니다. 압델라만 엘만잘라위와 함께 절차를 시연하는 것은 NRC의 의료기기 연구 센터의 기술 책임자인 크리스티나 나시프(Christina Nassif)가 될 것입니다.단백질 키나아제 K의 마이크로리터 20과 400 마이크로리터의 리시스 결합 버퍼를 자기 구슬을 포함하는 400 마이크로리터를 PBS의 100 마이크로리터에 새로 해동된 인간 말초 혈액 단핵세포와 철저히 혼합하여 시작합니다. 실온에서 5분 간 인큐베이션을 한 후, 체퍼를 제거하기 전에 튜브를 자기 랙에 1~2분 간 놓습니다. 자석에서 제거된 튜브를 사용하여, 특별히 결합되지 않은 구슬을 제거하기 위해 600 마이크로리터의 세척 버퍼 1에서 DNA 비드 복합체를 다시 중단합니다.튜브를 자석에 다시 놓고 상체를 제거할 수 있도록 한 후, 600 마이크로리터의 세척 버퍼 2에서 세포를 세척합니다. 상체를 제거한 후, 튜브가 자석에서 1분 동안 공기 건조를 한 후 100 마이크로리터의 용출 버퍼를 튜브에 철저한 혼합으로 추가하도록 합니다. 이어서, 자기 용액을 1~2분 동안 자기 랙에 놓고 자기 구슬을 암시된 DNA로부터 분리하고, 정제된 DNA 용액을 새로운 튜브로 옮기다.정제된 DNA의 비황핏 변환을 위해, 암시된 DNA 샘플의 20마이크로리터를 PCR 튜브로 옮기고, 130마이크로리터의 변환 시약을 튜브로 추가한다. 철저한 혼합 후 튜브 내용물들을 잠시 회전시키고 열 사이클러에서 DNA를 증폭시합니다. 주기의 끝에서, 수집 튜브에 배치 된 이온 크로마토그래피 컬럼에 결합 버퍼의 600 마이크로 리터를 추가하고, 컬럼에 DNA를 추가합니다.튜브를 여러 번 반전하여 혼합하고 원심분리기를 최대 속도로 30초 동안 사용합니다. 수집된 흐름을 폐기하고 100마이크로리터의 세척 버퍼를 열에 추가합니다. 컬럼을 원심분리하고 설명한 대로 흐름을 다시 버립니다.실온에서 15~20분 동안 열에 200마이크로리터의 데술포네이션 버퍼를 넣고 샘플을 원심분리하고 설명한 대로 흐름을 폐기합니다. 다음으로, 세척당 200 마이크로리터의 세척 버퍼로 컬럼을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 수집 튜브로 옮기고 100 마이크로리터의 PCR 급 물을 컬럼 막에 추가합니다.그런 다음, 전신속도로 1분 동안 컬럼의 원심분리로 DNA를 엘테한다. 액적 생성을 위해 비황피테 변환 된 DNA 의 마이크로 리터 1 개를 PCR 튜브에 새로 준비 된 프로브 마스터 믹스와 혼합하고 간단한 원심 분리로 샘플을 수집합니다. 피크 피팅을 사용하여 일회용 유체 튜브를 250 마이크로리터 볼륨 정밀 유리 주사기 2개에 연결합니다.그리고 5%의 밀가루 계면활성제를 함유한 250마이크로리터의 정밀 유리 주사기 1개, 캐리어 오일 50마이크로리터가 포함된 정밀 유리 주사기 1개를 미리 채웁니다. 두 주사기를 모두 적재하면 PCR의 100 마이크로리터를 캐리어 오일 주사기에 넣고, 고속 카메라가 장착된 직립 광 현미경의 단계에 액적 미세 유체 장치를 놓습니다. 실시간으로 액적 형성의 관찰 및 기록을 위해 미리 채워진 주사기를 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 배치하고 피팅과 피크 조합을 사용하여 주사기의 튜브를 액적 미세 유체 장치의 각 입구 채널의 튜브에 연결합니다.물방울 발생기의 출구에서 0.5 밀리리터 PCR 튜브의 안쪽으로 튜브를 배치하고, 주사기 펌프 유량을 분당 2마이크로리터로 조정하여 액적 크기가 안정화되어 에멀젼을 수집합니다. 튜브 상단에서 천천히 조심스럽게 에멀젼을 수집하고 용액의 75 마이크로리터를 200 마이크로리터 PCR 튜브로 이송하여 열 사이클링을 합니다. 그런 다음 PCR 튜브의 오일 함량이 분산 된 상의 부피와 밀접하게 일치하고 열 순환 중에 물방울의 결합을 방지하고 200 마이크로 리터 튜브를 열 사이클러에 배치합니다.유화 된 샘플의 형광 이미징의 경우 PCR 에멀젼을 직사각형 프로파일이있는 50 마이크로 미터 깊이의 보로실리케이트 모세관 튜브로 전송하여 액적액을 가까운 단일 층으로 배열하여 이미징을 위한 밀폐 된 단층으로 배열할 수 있습니다. 모세혈관을 현미경 슬라이드에 고정하고 밀봉한 후 슬라이드를 반전 된 현미경의 단계에 로드합니다. 현미경 이미징 소프트웨어에서 실시간 카메라 수집을 시작하기 위해 빠르게 획득하고 라이브를 선택합니다.그런 다음, 밝은 필드 및 형광 현미경 검사의 밑에 견본을 관찰합니다. 액적 생성 및 열 사이클링에 이어, 액적은 1밀리미터 너비와 50마이크로미터 높이의 유리 모세관에 도입될 수 있습니다. 형광 이미지 획득에 이상적인 액적의 단층 분포를 얻으려면 각 파장에 대해 이미지를 기록할 수 있습니다.이미지 분석 후, 각각의 형광에 있는 모든 액적물의 형광 강도는 양수 및 음수 액적의 임계값을 확립하기 위해 플롯될 수 있다. 식별 및 계수 후, 액적 값당 사본을 계산할 수 있으며, CD3+T-셀 및 CD4+25+조절 T-셀의 백분율은 총 세포 또는 C-less 유전자의 액적당 사본과 관련하여 각각 메틸화 CD3Z 및 FOXP3 사본에 따라 결정될 수 있다. 백분율 값은 그 때 적당한 항체를 사용하여 면역 형광 화상 진찰을 통해 얻은 것과 비교될 수 있습니다.나는 열 사이클링및 최종 액적 이미징 단계를 통해 액적 생성에서 에멀젼 안정성이 정확하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 정량화 결과를 얻는 데 중요하다고 생각합니다. 맞춤형 PCR 혼합 제형을 통한 MD PCR 커스터마이징은 단일 세포 수준에서 암 연구, 전염병 진단 및 분석을 포함한 다수의 응용 분야에 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

연구

생체공학

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

액적 병합 후 형광 복구 인지질 단분자막 이차원 확산을 측정하도록

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

질병 진단을위한 휴대용 이미징 및 분석과 결합 자기 부상

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

유 방 암 아카이브 자료를 사용 하 여 다중 RNA 기반 식 분석 결과의 최적화

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 DNA Amplicons 위한 스피어 PCR 증폭

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors 프로 테아 제 활동에 감지 비보에 비 침 투 적인 진단에 대 한

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...