Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner økonomisk støtte fra National Research Council of Canada.

Alle eksperimentene som ble utført i denne studien som involverte menneskelige prøver ble godkjent av NRCs etikkråd og ble gjort i henhold til NRCs retningslinjer for menneskelige som følger gjeldende forskningsretningslinjer og er i samsvar med lovene i Québec, Canada.
1. Celle forberedelse
<ol><li>Tin de frosne mononukleære cellene i humant perifert blod (PBMCer) umiddelbart ved å plassere kryovialen i et vannbad ved 37 °C i 5 min.</li>
	<li>Inverter kryovial to ganger for å forsi...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

Den presenterte eksperimentelle protokollen og metodene tillater internt mdPCR ved hjelp av en fabrikkert TPE-dråpegenerator, en termisk cycler og fluorescensmikroskop. Den fabrikkerte enheten ved hjelp av myk TPE til TPE-binding gir hydrofobe overflateegenskaper som er ensartede på tvers av alle kanalvegger, slik at den endelige enheten ikke krever overflatebehandling for etterfølgende bruk som dråpegenerator. Dette materialet har vært rutinemessig ansatt i point-of-care plattformer som krever kompatibilitet med h?...

Analyse av sammensetning av hvite blodlegemer (WBCer) er blant de mest etterspurte laboratorietestene i hematologisk diagnostikk. Differensial leukocytt teller fungerer som en indikator for et spekter av sykdommer, inkludert infeksjon, betennelse, anemi, og leukemi, og er under etterforskning som en tidlig prognostisk biomarkør for flere andre forhold også. Gullstandard i WBC-underskriving innebærer immunstaining og/eller strømningscytometri som begge krever kostbare, ustabilitetsutsatte fluorescerende antistoffer og er ofte svært avhengige av operatørferdigheter i prøveforberedelse. Videre gjelder denne metoden kun for ferske blodprøver, slik at prøvene ikke kan fryses for forsendelse eller senere analyse.
Epigenetiske markører har nylig dukket opp som kraftige analytiske verktøy for studiet av fenotypiske variasjoner. Deretter har humane leukocytterpopulasjoner vist seg å ha cellelinje DNA-metyleringsmønstre som tillater nøyaktig karakterisering av WBC-undergrupper. Subtyping basert på epigenetiske markører gir et lovende alternativ som ikke er avhengig av fersk blodprøve samling eller dyre antistoffer og kan utnyttes som en biomarkør for sykdom utbruddet ogmottakelighet 1,2,3,4,5.
Genomomfattende studier er utført for omfattende kartlegging av metylertspesifikke CG-rike regioner i genomet (CpG-øyene) i leukocytterundertyper for å identifisere kandidatepigenetiske markører som er spesifikke for leukocytterundertyper. PCR-protokoller er utviklet på grunn av denne årsaken til metylert genregioner, for eksempel CD3Z og FOXP3, tilsvarende CD3+ T-celler og CD4+ CD25+ Regulatoriske T-celler (T-Regs), henholdsvis. Wiencke et al. har demonstrert nytten av dupleksdråpe PCR for epigenetisk underskriving av T-celler, noe som gir resultater som er svært korrelerer med flytaktivert cellesortering (FACS) analyse6. Denne kvantitative genetiske analysemetoden er avhengig av å partisjonere malen nukleinsyremolekyler og PCR-reagenser i tusenvis av diskrete, volumetrisk definerte, sub-nanoliter størrelse dråper som inneholder null, en eller flere mål nukleinsyre kopier, ved hjelp av vann-i-olje emulsjoner aktivert av microflucs7,8. PCR-forsterkningen utføres innenfor hver enkelt dråpe, og endepunktets fluorescensintensitet for hver dråpe måles, slik at absolutt kvantifisering av mål som finnes i prøven. Dråpe-PCR er etablert for å være mer presis, nøyaktig og teknisk enklere enn standard qPCR, noe som gjør det til en gunstigere DNA-metyleringsbasert metode for klinisk evaluering av T-celler. Selv om en raskt fremvoksende underskrivingsmetodikk, mangler multipleksed epigenetisk analyse for å sondere for ulike metylerte CpG-regioner samtidig. Dette er nødvendig for rutinemessig leukocytt differensial teller.
Her presenteres en termoplastisk elastomer (TPE) dråpe mikrofluidisk enhet og brukes for metyleringsspesifikt multipleksdråpe PCR (mdPCR). Teknologien har blitt brukt til å avgrense spesifikke leukocytter undertyper, CD3+ T-celler og CD4+ CD25+ T-Regs, basert på celle-lineage DNA metylering mønstre, det vil si epigenetisk variasjon av CD3Z og FOXP3 CpG regioner, henholdsvis. En detaljert protokoll for DNA-ekstraksjon, bisulfittkonvertering og mdPCR er beskrevet sammen med en fabrikasjonsmetode for en TPE-dråpegenereringsenhet. Representative resultater av metoden sammenlignes med de av immunofluorescence farging fremhever nytten av den foreslåtte tilnærmingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

En multipleksed dråpe PCR (mdPCR) arbeidsflyt og detaljert protokoll for å bestemme epigenetisk-baserte hvite blodlegemer (WBC) differensial teller er beskrevet, sammen med en termoplastisk elastomer (TPE) mikrofluidisk dråpe generasjon enhet. Epigenetiske markører brukes til WBC-underskriving som er av viktig prognostisk verdi i forskjellige sykdommer. Dette oppnås gjennom kvantifisering av DNA-metyleringsmønstre av spesifikke CG-rike regioner i genomet (CpG loci). I dette papiret er bisulfittbehandlet DNA fra perifere blodmononukleære celler (PBMCer) innkapslet i dråper med mdPCR-reagenser, inkludert primere og hydrolysefluoresestråler som er spesifikke for CpG loci som korrelerer med WBC-underpopulasjoner. Multiplekstilnærmingen muliggjør avhør av mange CpG loci uten behov for separate mdPCR-reaksjoner, noe som muliggjør mer nøyaktig parametrisk bestemmelse av WBC-underpopulasjoner ved hjelp av epigenetisk analyse av metyleringssteder. Denne presise kvantifiseringen kan utvides til ulike applikasjoner og fremhever fordelene for klinisk diagnose og påfølgende prognose.

Den TPE-baserte mikrofluidiske dråpegeneratorenheten ble fabrikkert ved hjelp av den beskrevne protokollen som vist i figur 1. En gjennomsiktig maske ble brukt i fotolitografi for å oppnå silisium (Si) master. Myk litografi ble utført for å få en omvendt PDMS kopi av Si-mesteren som deretter ble brukt til å fremstille epoksyformen. Epoxy forløper ble strømmet på PDMS og kurert for å krysslinke og herde. Denne formen, som representerer den nøyaktige kopien av Si-mesteren, var mer ...

Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Epigenetiske markører brukes til underskriving av hvite blodlegemer (WBC) gjennom kvantifisering av DNA-metyleringsmønstre. Denne protokollen presenterer en multipleks dråpepolymerasekjedereaksjonsmetode (mdPCR) ved hjelp av en termoplastisk elastomer (TPE)-basert mikrofluidisk enhet for dråpegenerering, noe som gir presis og multipleks metyleringsspesifikk målkvantifisering av WBC differensialtellinger.

Metyleringsspesifikk Multiplex dråpe PCR ved hjelp av polymerdråpegeneratorenhet for hematologisk diagnostikk

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Denne protokollen presenterer en fleksibel multipleks dråpe PCR arbeidsflyt som tillater presis differensial leukocytter telling basert på epigenetiske metylering markører. Denne fleksibiliteten kan legge til rette for oversettelse av mdPCR til klinisk bruk. Denne metoden gir resultater som spør nøye til de som er oppnådd ved hjelp av immunofluorescerende fargingsmetoder.I motsetning til immunofluorescent farging, men, denne metoden krever ikke friske blodprøver eller kostbare antistoffer. I hematologiske diagnostikk kan differensial leukocytt tjene som indikatorer for et spekter av sykdommer, inkludert infeksjon, betennelse, anemi og leukemi, og blir betraktet som en tidlig prognostisk kreftbiomarkør. Demonstrere prosedyren med Abdelrahman Elmanzalawy vil være Christina Nassif, en teknisk offiser fra vårt team ved NRC Medical Device Research Centre.Begynn med å blande 20 mikroliter proteinkinase K og 400 mikroliter lysisbindingsbuffer som inneholder magnetiske perler med nytinte humane perifere blodmonukleære celler i 100 mikroliter PBS. Etter en fem minutters inkubasjon ved romtemperatur, plasser røret på et magnetisk stativ i ett til to minutter før du fjerner det overnaturlige. Med røret fjernet fra magneten, re-suspendere DNA perle kompleks i 600 mikroliter av vaskebuffer en å fjerne eventuelle ikke-spesifikt bundet perler.Plasser røret tilbake på magneten for å tillate fjerning av supernatanten, før du vasker cellene i 600 mikroliter vaskebuffer to som nettopp demonstrert. Etter å ha fjernet det overnaturlige, la røret lufttørke på magneten i ett minutt før du legger til 100 mikroliter elutionbuffer til røret med grundig blanding. Deretter plasserer du røret på magnetstativet i ett til to minutter for å skille de magnetiske perlene fra det hentydede DNA-et, og overfører den rensede DNA-løsningen til et nytt rør.For bisulfittkonvertering av renset DNA, overfør 20 mikroliter av den hentydede DNA-prøven til et PCR-rør, og tilsett 130 mikroliter konverteringsreagens til røret. Etter grundig blanding, kort spinne ned røret innholdet og forsterke DNA på en termisk cycler. På slutten av syklusen legger du til 600 mikroliter med bindingsbuffer til en ionkromatografikolonne plassert i et innsamlingsrør, og legger til DNA i kolonnen.Inverter røret flere ganger for å blande, og sentrifuge i 30 sekunder med full hastighet. Kast den oppsamlede strømmen gjennom, og legg til 100 mikroliter vaskebuffer i kolonnen. Sentrifuger kolonnen og kast gjennomstrømningen igjen som demonstrert.Tilsett 200 mikroliter desulfonasjonsbuffer i kolonnen i en 15 til 20 minutters inkubasjon ved romtemperatur, før du sentrifuger prøven og forkaster gjennomstrømningen som vist. Vask deretter kolonnen to ganger med 200 mikroliter vaskebuffer per vask. Etter den andre vasken, overfør kolonnen til et nytt 1,5 milliliter oppsamlingsrør, og legg til 100 mikroliter PCR-grade vann til membranen i kolonnen.Deretter elute DNA ved sentrifugering av kolonnen i ett minutt i full fart. For dråpegenerering, bland en mikroliter bisulfittkonvertert DNA med nylaget sondemasterblanding i et PCR-rør, og samle prøven med en kort sentrifugering. Bruk toppbeslag for å koble engangsvæskeslang til to 250 mikroliter volum presisjonsglasssprøyter.Og fyll en presisjonsglasssprøyte med 250 mikroliter bæreolje som inneholder 5 % flouro overflateaktivt middel, og en presisjonsglasssprøyte med 50 mikroliter bæreolje. Når begge sprøytene er lastet, laster du 100 mikroliter av PCR-blandingen inn i sprøyten med bærerolje, og plasserer en mikrofluidisk dråpeenhet på scenen av et oppreist lysmikroskop utstyrt med et høyhastighetskamera. For observasjon og registrering av dråpedannelse i sanntid, plasser de ferdigfylte sprøytene på en programmerbar sprøytepumpe, og bruk toppunion med beslag for å koble slangene til slangene til slangen til de respektive innløpskanalene til dråpemikrofluidisk enhet.Plasser slangen fra utløpet av dråpegeneratoren til innsiden av et 0,5 milliliter PCR-rør, og juster sprøytepumpestrømningshastigheten til to mikroliter per minutt, slik at dråpestørrelsen stabiliseres før den resulterende emulsjonen samles. Sakte og forsiktig samle emulsjon fra toppen av røret, og overføre 75 mikroliter av løsningen til en 200 mikroliter PCR rør for termisk sykling. Deretter bekrefter du at oljeinnholdet i PCR-røret samsvarer tett med volumet av den dispergerte fasen, for å forhindre kokulering av dråpene under termisk sykling, og plasser 200 mikroliterrøret i den termiske cycleren.For fluorescensavbildning av den emulgerte prøven, overfør PCR-emulsjonen til et 50-mikrometer dypt borosilikatkapillærrør med en rektangulær profil, for å tillate arrangement av dråpene til et tettpakket monolag for avbildning. Etter å ha festet og forseglet kapillærene på et mikroskopsklie, laster du lysbildet på scenen av det inverterte mikroskopet. Og i mikroskopbildeprogramvaren velger du kjøp og lever raskt, for å starte kameraoppkjøp i sanntid.Deretter observerer du prøven under lyst felt og fluorescensmikroskopi. Etter dråpegenerering og termisk sykling kan dråpene introduseres i en glasskapillær med en 1-millimeters bredde og en 50-mikrometerhøyde. For å få en monolayer distribusjon av dråpene som er ideell for fluorescens bildeanskaffelse, kan bilder deretter registreres for hver bølgelengde.Etter bildeanalyse kan fluorescensintensiteten til alle dråpene i sine respektive fluoroforer plottes for å etablere terskelen for de positive og negative dråpene. Etter identifisering og telling kan kopiene per dråpeverdier beregnes, og prosentandelen av CD3+T-celler og CD4+25+regulatoriske T-celler kan bestemmes basert på henholdsvis de metylerte CD3Z- og FOXP3-kopiene, med hensyn til kopiene per dråpe av totalcellene eller C-mindre genet. Prosentverdiene kan deretter sammenlignes med de som oppnås gjennom immunofluorescence imaging ved hjelp av de riktige antistoffene.Jeg tror emulsjonsstabiliteten fra dråpegenerasjonen gjennom termisk sykling og endelige dråpebildetrinn er avgjørende for å oppnå presise, pålitelige og reproduserbare kvantifiseringsresultater. MD PCR tilpasning gjennom skreddersydd PCR mix formulering kan brukes til en rekke applikasjoner, inkludert kreftforskning, smittsomme sykdommer diagnose og analyse på enkeltcellenivå.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescens deteksjon metoder for microfluidic dråpe plattformer

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjelp av en Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescens Recovery etter Flette en Droplet Mål To-dimensjonal Diffusion of et fosfolipid med ett lag

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Bruke optiske fibre

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Sirkulasjons mikroRNA Kvantifisering Bruke DNA-bindende Dye kjemi og Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Magnetisk Levitation Sammen med Portable Imaging and Analysis for sykdomsdiagnostikk

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimalisering av en Multiplex RNA-baserte uttrykk analysen bruker bryst kreft arkivmateriale

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

En dråpe Microfluidic tilnærming og Microsphere PCR forsterkning for Single-strandet DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors til å oppdage Protease aktivitet i Vivo Noninvasive diagnostikk

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...