Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Os autores reconhecem o apoio financeiro do Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá.

Todos os experimentos realizados neste estudo envolvendo amostras humanas foram aprovados pelo Conselho de Ética do NRC e foram feitos de acordo com as políticas do NRC que regem os sujeitos humanos que seguem as diretrizes de pesquisa aplicáveis e estão em conformidade com as leis em Québec, Canadá.
1. Preparação celular
<ol><li>Descongele as células mononucleares de sangue periféricos congelados (PBMCs) imediatamente colocando o criovial em um banho de água a 37 °C por 5 min.</...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

O protocolo experimental apresentado e os métodos permitem o mdPCR interno usando um gerador de gotícula TPE fabricado, um cicloviário térmico e microscópio de fluorescência. O dispositivo fabricado usando tpe macio para ligação TPE oferece propriedades de superfície hidrofóbica que são uniformes em todas as paredes do canal, de tal forma que o dispositivo final não requer qualquer tratamento de superfície para uso subsequente como gerador de gotículas. Este material tem sido rotineiramente empregado em pla...

A análise da composição dos glóbulos brancos (WBCs) está entre os exames laboratoriais mais solicitados em diagnósticos hematológicos. A contagem diferencial de leucócitos serve como um indicador para um espectro de doenças, incluindo infecção, inflamação, anemia e leucemia, e está sendo investigada como um biomarcador prognóstico precoce para várias outras condições também. O padrão-ouro na subtipagem WBC envolve a imunostenção e/ou citometria de fluxo, ambos que requerem anticorpos fluorescentes caros e propensos à instabilidade e são muitas vezes altamente dependentes da proficiência do operador na preparação da amostra. Além disso, este método é aplicável apenas a amostras de sangue fresco, de modo que as amostras não podem ser congeladas para embarque ou análise posterior.
Os marcadores epigenéticos surgiram recentemente como poderosas ferramentas analíticas para o estudo de variações fenotípicas. Posteriormente, as populações de leucócitos humanos têm mostrado ter padrões de metilação de DNA de linhagem celular que permitem a caracterização precisa dos subconjuntos WBC. A subtipagem baseada em marcadores epigenéticos fornece uma alternativa promissora que não depende de coleta de amostras de sangue fresco ou anticorpos caros e pode ser explorada como biomarcadora para o aparecimento da doença e suscetibilidade1,,2,3,,4,5.
Estudos em todo o genoma têm sido realizados para mapeamento extensivo de regiões ricas em CG específicas metiladas no genoma (ilhas CpG) em subtipos de leucócitos para identificar marcadores epigenéticos candidatos específicos para subtipos de leucócitos. Os protocolos PCR foram desenvolvidos por essa razão para regiões genéticas metiladas, por exemplo, CD3Z e FOXP3, correspondentes a CD3+ T-Cells e CD4+ CD25+ Células T Regulatórias (T-Regs), respectivamente. Wiencke et al. demonstraram a utilidade do PCR de gotícula duplex para subtipagem epigenética de Células T, produzindo resultados altamente correlacionados com a análise de classificação celular ativada de fluxo (FACS)6. Este método de análise genética quantitativa baseia-se na particionamento das moléculas de ácido nucleico modelo e reagentes PCR em milhares de gotículas discretas, volumosicamente definidas, sub-nanoliteras contendo zero, uma ou mais cópias de ácido nucleico alvo, utilizando emulsões de água em óleo habilitadas por microfluidos7,,8. A amplificação do PCR é realizada dentro de cada gotícula individual e a intensidade de fluorescência de ponto final de cada gotícula é medida, permitindo quantificação absoluta dos alvos presentes na amostra. O CDR gotícula foi estabelecido para ser mais preciso, preciso e tecnicamente mais simples do que o qPCR padrão, tornando-o um método mais favorável baseado em metilação de DNA para avaliação clínica de Células T. Embora uma metodologia de subtipagem rapidamente emergente, a análise epigenética multiplexada para sondar várias regiões de CpG metiladas simultaneamente está em falta. Isso é necessário para contagem diferencial de leucócito de rotina.
Aqui, um dispositivo microfluido de gotícula termoplástica (TPE) é apresentado e empregado para pcr de gotícula multiplex específica de metilação (mdPCR). A tecnologia tem sido usada para delinear subtipos específicos de leucócitos, CD3+ T-Cells e CD4+ CD25+ T-Regs, baseados em padrões de metilação de DNA de linhagem celular, ou seja, variação epigenética das regiões CD3Z e FOXP3 CpG, respectivamente. Um protocolo detalhado para extração de DNA, conversão de bissulfito e mdPCR é descrito em conjunto com um método de fabricação para um dispositivo de geração de gotículas TPE. Os resultados representativos do método são comparados aos da coloração da imunofluorescência, destacando a utilidade da abordagem proposta.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

Um fluxo de trabalho de gotícula multiplexada PCR (mdPCR) e um protocolo detalhado para determinar a contagem diferencial de células brancas baseadas em epigenética (WBC) são descritos, juntamente com um dispositivo de geração de gotículas microfluida (TPE) termoplástico. Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem WBC que é de importante valor prognóstico em diferentes doenças. Isso é conseguido através da quantificação dos padrões de metilação de DNA de regiões específicas ricas em CG no genoma (CpG loci). Neste artigo, o DNA tratado por bisulfita de células mononucleares de sangue periféricos (PBMCs) é encapsulado em gotículas com reagentes mdPCR, incluindo primers e sondas fluorescentes de hidrólise específicas para loci de CpG que se correlacionam com sub-populações WBC. A abordagem multiplex permite o interrogatório de muitos locis de CpG sem a necessidade de reações mdPCR separadas, permitindo uma determinação paramétrica mais precisa das subsépas WBC usando análise epigenética de locais de metilação. Essa quantificação precisa pode ser estendida a diferentes aplicações e destaca os benefícios para o diagnóstico clínico e prognóstico subsequente.

O dispositivo gerador de gotícula microfluida baseado em TPE foi fabricado usando o protocolo descrito, conforme mostrado na Figura 1. Uma máscara de transparência foi usada na fotolitografia para obter o mestre de silício (Si). A litografia suave foi realizada para obter uma réplica inversa do Mestre Si, que foi então usada para fabricar o molde epóxi. O precursor epóxi foi derramado no PDMS e curado para cruzar e endurecer. Este molde, representando a réplica exata do mestre Si fo...

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Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem de glóbulos brancos (WBC) através da quantificação dos padrões de metilação de DNA. Este protocolo apresenta um método de reação em cadeia de polimerase de gotícula multiplex (mdPCR) usando um dispositivo microfluido baseado em elastômero termoplástico (TPE) para geração de gotículas permitindo quantificação de alvo específica e multiplex específica da contagem diferencial WBC.

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR usando dispositivo gerador de gotícula de polímero para diagnósticos hematológicos

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho PCR de gotícula multiplex flexível que permite a contagem precisa de leucócitos diferenciais com base em marcadores de metilação epigenética. Essa flexibilidade pode facilitar a tradução do mdPCR para uso clínico. Este método fornece resultados que consultam de perto aqueles obtidos usando métodos de coloração imunofluorescentes.Ao contrário da coloração imunofluorescente, no entanto, este método não requer amostras de sangue fresco ou anticorpos caros. Nos diagnósticos hematológicos, o leucócito diferencial pode servir como indicadores para um espectro de doenças, incluindo infecção, inflamação, anemia e leucemia, e está sendo considerado como um biomarcador de câncer prognóstico precoce. Demonstrando o procedimento com Abdelrahman Elmanzalawy será Christina Nassif, uma oficial técnica da nossa equipe no Centro de Pesquisa de Dispositivos Médicos da NRC.Comece misturando completamente 20 microliters de proteína quinase K e 400 microliters de tampão de ligação de lise contendo contas magnéticas com células mononucleares de sangue periféricos humanos recém-descongeladas em 100 microlitrais de PBS. Após uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, coloque o tubo em um rack magnético por um a dois minutos antes de remover o sobrenante. Com o tubo removido do ímã, suspenda o complexo de contas de DNA em 600 microliters de tampão de lavagem um para remover quaisquer contas não especificamente ligadas.Coloque o tubo de volta no ímã para permitir a remoção do supernascer, antes de lavar as células em 600 microliters de tampão de lavagem dois como apenas demonstrado. Depois de remover o supernascer, deixe o tubo secar no ímã por um minuto antes de adicionar 100 microliters de tampão de eluição ao tubo com uma mistura completa. Em seguida, coloque o tubo no rack magnético por um a dois minutos para separar as contas magnéticas do DNA aludido, e transferir a solução de DNA purificada para um novo tubo.Para a conversão de bisulfato do DNA purificado, transfira 20 microliters da amostra de DNA aludido para um tubo PCR, e adicione 130 microliters de reagente de conversão ao tubo. Após uma mistura minuciosa, gire brevemente o conteúdo do tubo e amplie o DNA em um cicloviário térmico. No final do ciclo, adicione 600 microliters de tampão de ligação a uma coluna de cromatografia de íons colocada em um tubo de coleta, e adicione o DNA à coluna.Inverta o tubo várias vezes para misturar, e centrífuga por 30 segundos a toda velocidade. Descarte o fluxo coletado e adicione 100 microliters de tampão de lavagem à coluna. Centrifugar a coluna e descartar o fluxo novamente como demonstrado.Adicione 200 microliters de Tampão de Dessulfonação à coluna para uma incubação de 15 a 20 minutos à temperatura ambiente, antes de centrifugar a amostra e descartar o fluxo-through como demonstrado. Em seguida, lave a coluna duas vezes com 200 microliters de tampão de lavagem por lavagem. Após a segunda lavagem, transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 1,5 mililitros e adicione 100 microliters de água de grau PCR à membrana da coluna.Então, elute o DNA por centrifugação da coluna por um minuto a toda velocidade. Para a geração de gotículas, misture um microliter de DNA convertido por bisulfato com uma mistura mestre de sonda recém-preparada em um tubo PCR, e colete a amostra com uma breve centrifugação. Use encaixes de pico para conectar tubos fluidos descartáveis a duas seringas de vidro de precisão de volume de 250 microliter.E pré-encha uma seringa de vidro de precisão com 250 microliters de óleo transportador contendo 5% de farinhao surfactante, e uma seringa de vidro de precisão com 50 microliters de óleo transportador. Quando ambas as seringas tiverem sido carregadas, carregue 100 microlitros do PCR na seringa do óleo transportador e coloque um dispositivo microfluido gotícula no palco de um microscópio de luz vertical equipado com uma câmera de alta velocidade. Para a observação e registro da formação de gotículas em tempo real, coloque as seringas pré-enchidas em uma bomba de seringa programável e use a união de pico com encaixes para conectar a tubulação das seringas à tubulação dos respectivos canais de entrada do dispositivo microfluídico gotícula.Coloque a tubulação da saída do gerador de gotículas para o interior de um tubo PCR de 0,5 mililitro e ajuste a taxa de fluxo da bomba de seringa para dois microliters por minuto, para permitir que o tamanho da gotícula se estabilize antes de coletar a emulsão resultante. Coletar lentamente e cuidadosamente a emulsão do topo do tubo, e transferir 75 microliters da solução para um tubo PCR de 200 microliteres para ciclismo térmico. Em seguida, confirme que o teor de óleo no tubo PCR corresponde de perto ao volume da fase dispersa, para evitar a coalescência das gotículas durante o ciclismo térmico e coloque o tubo de 200 microliter no cicloviário térmico.Para imagens de fluorescência da amostra emulsificada, transfira a emulsão pcr em um tubo capilar de borossilicato de 50 micrômetros profundos com um perfil retangular, para permitir o arranjo das gotículas em uma monocamada fechada para imagem. Depois de fixar e selar os capilares em um slide de microscópio, carregue o slide no estágio do microscópio invertido. E no software de imagem de microscópio, selecione adquirir e viver rápido, para iniciar a aquisição de câmeras em tempo real.Em seguida, observe a amostra sob campo brilhante e microscopia de fluorescência. Após a geração de gotículas e o ciclismo térmico, as gotículas podem ser introduzidas em um capilar de vidro com uma largura de um milímetro e uma altura de 50 micrômetros. Para obter uma distribuição monocamada das gotículas ideais para aquisição de imagens de fluorescência, as imagens podem então ser gravadas para cada comprimento de onda.Após a análise da imagem, a intensidade da fluorescência de todas as gotículas em seus respectivos fluoroforos pode ser traçada para estabelecer o limiar das gotículas positivas e negativas. Após a identificação e contagem, as cópias por gotícula podem ser calculadas, e a porcentagem de células CD3+T, e células T cd4+25+regulamentares podem ser determinadas com base nas cópias metiladas CD3Z e FOXP3, respectivamente, com relação às cópias por gotícula do gene total ou c-less. Os valores por cento podem então ser comparados aos obtidos através de imagens de imunofluorescência usando os anticorpos apropriados.Penso que a estabilidade da emulsão desde a geração de gotículas até as etapas de ciclismo térmico e de imagem final de gotículas é crucial para obter resultados precisos, confiáveis e reprodutíveis de quantificação. A personalização do MD PCR através da formulação de mixagem pcr sob medida pode ser usada para uma série de aplicações, incluindo pesquisa sobre câncer, diagnóstico de doenças infecciosas e análises no nível único celular.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Bioengenharia

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Recuperação de fluorescência após a fusão uma gota de medir a difusão bidimensional de um Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Levitação magnética Juntamente com imagem Portátil e Análise para a doença Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

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Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors para detectar Protease atividade In Vivo para diagnóstico não-invasivo

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...