Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Авторы признают финансовую поддержку со стороны Национального исследовательского совета Канады.

Все эксперименты, проведенные в этом исследовании с участием образцов человека, были одобрены Советом по этике СРН и проводились в соответствии с политикой СРН, регулируя человеческие предметы, которые следуют применимым руководящим принципам исследований и соответствуют законам Кв?...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

Представленный экспериментальный протокол и методы позволяют в доме mdPCR с помощью изготовленного генератора капель TPE, тепловой циклер, и флуоресцентный микроскоп. Изготовленное устройство с использованием мягкого TPE для связи TPE обеспечивает гидрофобные свойства поверхности, которы?...

Анализ состава белых кровяных телец (WBCs) является одним из наиболее часто запрашиваемых лабораторных тестов в гематологической диагностике. Дифференциальное количество лейкоцитов служит индикатором для спектра заболеваний, включая инфекцию, воспаление, анемию и лейкемию, и находится под следствием в качестве раннего прогностический биомаркер для ряда других условий, а также. Золотой стандарт в субтипинге WBC включает в себя иммуностиметь и/или цитометрию потока, которые требуют дорогостоящих, подверженных нестабильности флуоресцентных антител и часто сильно зависят от квалификации оператора в подготовке образца. Кроме того, этот метод применим только к свежим образцам крови, так что образцы не могут быть заморожены для отгрузки или более поздний анализ.
Эпигенетические маркеры в последнее время стали мощными аналитическими инструментами для изучения фенотипических вариаций. Впоследствии было показано, что популяции лейкоцитов человека имеют модели метилирования ДНК клеточной линии, которые позволяют точно о характеристике подмножества WBC. Субтипирование на основе эпигенетических маркеров обеспечивает перспективную альтернативу, которая не зависит от сбора свежих образцов крови или дорогих антител и может быть использована в качестве биомаркера для начала заболеванияи восприимчивости 1,,2,,3,,4,,5.
Геномные исследования были проведены для обширного картирования метилированных конкретных богатых CG регионов в геноме (CpG островов) в подтипах лейкоцитов для выявления кандидатов эпигенетических маркеров, характерных для подтипов лейкоцитов. Протоколы ПЦР были разработаны по этой причине для метилированных областей генов, например, CD3 и FOXP3, соответствующихCD3 и T-Cells и CD4и CD25- Регуляторные Т-клетки (T-Regs), соответственно. Wiencke et al. продемонстрировали полезность дуплексной капли PCR для эпигенетического субтипирования Т-клеток, что дает результаты, которые сильно коррелируют с анализом активированной клетки потока (FACS)6. Этот метод количественного генетического анализа опирается на разделение молекул нуклеиновой кислоты шаблона и реагентов ПЦР на тысячи дискретных, объемно определенных, субнолитровых капель, содержащих ноль, одну или несколько копий целевой нуклеиновой кислоты, с использованием эмульсий воды в масле, включенныхмикрофлюиды 7,8. Усиление ПЦР выполняется в каждой отдельной капле, и измеряется интенсивность флуоресценции конечной точки каждой капли, что позволяет абсолютно количественно оценить целевые показатели, присутствующие в выборке. Droplet PCR был создан, чтобы быть более точным, точным и технически проще, чем стандартный qPCR, что делает его более благоприятным методом метилирования ДНК для клинической оценки Т-клеток. Несмотря на быстро возникающие методологии субтипирования, мультиплексный эпигенетический анализ для исследования различных метилированных регионов CpG одновременно отсутствует. Это необходимо для обычного дифференциального отсчета лейкоцитов.
В этом случае представлено и использовано термопластичное еластомерное (ТПЭ) капельное микрофлюидное устройство для метилирования-специфической мультиплексной капли ПЦР (mdPCR). Технология была использована для разграничения конкретных подтипов лейкоцитов,CD3 и Т-клеток и CD4, CD25и T-Regs, на основе клеточных моделей метилирования ДНК, т.е. эпигенетической вариации регионов CD3 и FOXP3 CpG, соответственно. Подробный протокол для извлечения ДНК, преобразования бисульфита и mdPCR описывается в согласовании с методом изготовления для устройства генерации капель TPE. Репрезентативные результаты метода сравниваются с результатами окрашивания иммунофлуоресценции, подчеркивая полезность предлагаемого подхода.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

Описан мультиплексный рабочий процесс ПЦР (mdPCR) и подробный протокол для определения эпигенетических белых кровяных телец (WBC) дифференциального числа, наряду с термопластичным еластомером (TPE) микрофлюидным устройством генерации капель. Эпигенетические маркеры используются для субтипирования WBC, который имеет важное прогностический значение при различных заболеваниях. Это достигается за счет количественной оценки моделей метилирования ДНК конкретных богатых CG регионов в геноме (cpG локусов). В этой работе, бисульфит-обработанной ДНК из периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) инкапсулируется в каплях с mdPCR реагентов, включая грунтовки и гидролиз флуоресцентные зонды, характерные для cpG локусов, которые коррелируют с суб-популяций WBC. Мультиплексный подход позволяет проводить допрос многих локусов CpG без необходимости отдельных реакций mdPCR, что позволяет более точно определить параметрические поднаселения WBC с использованием эпигенетического анализа мест метилирования. Эта точная количественная оценка может быть распространена на различные приложения и подчеркивает преимущества для клинической диагностики и последующего прогноза.

Устройство генератора микрофлюидных капель на основе TPE было изготовлено с использованием описанного протокола, как показано на рисунке 1. Маска прозрачности была использована в фотолитографии для получения кремния (Si) мастер. Мягкая литография была выполнена для полу?...

Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Эпигенетические маркеры используются для подзарядки белых кровяных телец (WBC) через количественную оценку моделей метилирования ДНК. Этот протокол представляет собой мультиплекс капли полимеразной цепной реакции (mdPCR) метод с использованием термопластичного еластомера (TPE) на основе микрофлюидного устройства для производства капель позволяет точной и мультиплекс метилирования конкретных целевых количественно WBC дифференциальных кол-

Метилирование специфических мультиплексных капель ПЦР с использованием полимерных капель генератор устройства для гематологической диагностики

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Этот протокол представляет собой гибкую мультиплексную капельку PCR рабочий процесс, который позволяет точное дифференциальное количество лейкоцитов на основе эпигенетических маркеров метилирования. Такая гибкость может облегчить перевод mdPCR в сторону клинического использования. Этот метод дает результаты, которые тесно запрос для тех, кто получил с помощью иммунофлуоресцентных методов окрашивания.Однако, в отличие от иммунофлуоресцентного окрашивания, этот метод не требует свежих образцов крови или дорогостоящих антител. В гематологической диагностике дифференциальные лейкоциты могут служить индикаторами спектра заболеваний, включая инфекцию, воспаление, анемию и лейкемию, и рассматриваются в качестве раннего прогностического биомаркера рака. Демонстрацией процедуры с Абдельрахман Эльманзалави будет Кристина Насиф, технический сотрудник нашей команды в Научно-исследовательском центре медицинского устройства NRC.Начните с тщательного смешивания 20 микролитров белковой киназы K и 400 микролитров буфера связывания лиза, содержащего магнитные бусины со свежеоттаями моноядерными клетками человеческой периферической крови в 100 микролитров PBS. После пятиминутной инкубации при комнатной температуре поместите трубку на магнитную стойку в течение одной-двух минут, прежде чем удалить супернатант. С трубкой удалены из магнита, повторно приостановить ДНК бисером комплекса в 600 микролитров мыть буфера один, чтобы удалить любые не специально связанные бусы.Поместите трубку обратно на магнит, чтобы удалить супернатант, перед мытьем клеток в 600 микролитров мыть буфера два, как только что продемонстрировали. После удаления супернатанта, дайте трубке высохнуть на магните в течение одной минуты, прежде чем добавить 100 микролитров буфера элюции в трубку с тщательным смешиванием. Затем поместите трубку на магнитную стойку на одну-две минуты, чтобы отделить магнитные бусы от ссылаемой ДНК и перенести очищенный раствор ДНК в новую трубку.Для преобразования бисульфита очищенной ДНК перенесите 20 микролитров ссылаемого образца ДНК в трубку ПЦР и добавьте в трубку 130 микролитров реагента преобразования. После тщательного смешивания, кратко спина вниз содержимое трубки и усилить ДНК на тепловой циклер. В конце цикла добавьте 600 микролитров связывающего буфера в ионный хроматографический столбец, помещенный в коллекторную трубку, и добавьте ДНК в столбец.Переверните трубку несколько раз, чтобы смешать, и центрифугу в течение 30 секунд на полной скорости. Отбросьте собранный поток через, и добавьте 100 микролитров буфера мытья к столбецу. Центрифуга колонны и отбросить поток через снова, как попродемонстрировано.Добавьте 200 микролитров буфера десульфонации в столбец для инкубации за 15-20 минут при комнатной температуре, прежде чем центрифугировать образец и отказаться от протекания, как это было продемонстрировано. Далее, мыть колонку два раза с 200 микролитров мыть буфера на стирку. После второй стирки перенесите колонку в новую трубку сбора 1,5 миллилитров и добавьте 100 микролитров воды класса ПЦР в мембрану колонны.Затем, elute ДНК центрифугации столбца в течение одной минуты на полной скорости. Для генерации капель смешайте один микролитр бисульфит-преобразованной ДНК со свежеприготовленной смесью мастера зонда в трубке ПЦР и соберите образец с краткой центрифугой. Используйте пиковые фитинги для подключения одноразовых жидкостных труб до двух 250-микролитровых точных стеклянных шприцев.И предварительно заполнить один точный стеклянный шприц с 250 микролитров несущего масла, содержащего 5%flouro surfactant, и один точный стеклянный шприц с 50 микролитров масла перевозчика. Когда оба шприца были загружены, загрузите 100 микролитров смеси ПЦР в шприц несущего масла и поместите капельное микрофлюидное устройство на сцену вертикального светового микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой. Для наблюдения и записи образования капель в режиме реального времени поместите предварительно заполненные шприцы на программируемый шприц-насос, а также используйте пиковый союз с фитингами для подключения труб шприцев к трубе соответствующих входных каналов микрофлюидного устройства капли.Поместите трубки из розетки генератора капель на внутреннюю сторону 0,5 миллилитров ПЦР трубки, и настроить скорость потока шприц насоса до двух микролитров в минуту, чтобы размер капли стабилизироваться перед сбором в результате эмульсии. Медленно и осторожно собирайте эмульсию из верхней части трубки и перенесите 75 микролитров раствора в 200 микролитровую трубку ПЦР для теплового езды на велосипеде. Затем подтвердите, что содержание масла в ПЦР-трубке близко соответствует объему рассеянной фазы, чтобы предотвратить слияние капель во время теплового цикла, и поместите 200 микролитровую трубку в тепловой циклер.Для флуоресценции изображения эмульгированного образца, передача эмульсии ПЦР в 50-микрометровую борозиликатную капиллярную трубку с прямоугольным профилем, чтобы позволить расположение капель в тесно упакованный монослой для визуализации. После фиксации и уплотнения капилляров на слайд микроскопа загрузите слайд на стадию перевернутого микроскопа. И в микроскоп изображения программного обеспечения, выберите приобрести и жить быстро, чтобы начать в режиме реального времени приобретение камеры.Затем наблюдайте за образцом под яркой полевой и флуоресцентной микроскопией. После генерации капель и теплового цикла капли могут быть введены в стеклянную капиллярную капиллярную систему шириной в один миллиметр и высотой 50 микрометров. Чтобы получить монослойное распределение капель, идеально подходит для получения изображения флуоресценции, изображения могут быть записаны для каждой длины волны.После анализа изображений флуоресценция всех капель в соответствующих флюорофорах может быть установлена для установления порога положительных и отрицательных капель. После идентификации и подсчета копий значения капли могут быть рассчитаны, а процент CD3-T-клеток и CD4-25-регулятивных Т-клеток может быть определен на основе метилированных копий CD3 и FOXP3 соответственно, по отношению к копиям на каплю общей клетки или C-менее гена. Процентные значения можно сравнить с значениями, полученными с помощью иммунофлуоресценции изображений с использованием соответствующих антител.Я думаю, что стабильность эмульсии от генерации капель через тепловой цикл и заключительные шаги по визуализации капель имеет решающее значение для получения точных, надежных и воспроизводимых результатов количественной оценки. MD PCR настройки с помощью индивидуальных ПЦР смесь формулировка может быть использована для ряда приложений, включая исследования рака, диагностики инфекционных заболеваний и аналитики на одном уровне клеток.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Высокая профилирования микроРНК Производительность: Оптимизированная Мультиплекс QRT-PCR на шкале Nanoliter на Fluidigm Динамический МФХБ ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Флуоресценция методы обнаружения микрофлюидных платформ капли

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Флуоресценции Восстановление после Слияние капли измерить двумерной диффузии фосфолипидов монослоя

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Многоцветная флуоресценция обнаружения для дроплета Microfluidics Использование оптических волокон

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Циркулирующие микроРНК Количественное Использование ДНК-связывающих Dye Химия и дроплет Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Магнитной левитации В сочетании с Портативный визуализации и анализа для заболевания Диагностика

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Оптимизация мультиплекс на базе РНК выражение Assay, с использованием архивных материалов рака молочной железы

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Подход, основанный на капельки Microfluidic и микросферы ПЦР-амплификации для одноцепочечной ДНК ампликонов

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Наносенсоры обнаружить протеазы активность In Vivo для неинвазивной диагностики

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...