Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
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Los autores reconocen el apoyo financiero del Consejo Nacional de Investigación de Canadá.

Todos los experimentos realizados en este estudio con muestras humanas fueron aprobados por la Junta de ética del NRC y se realizaron de acuerdo con las políticas de NRC que rigen a los sujetos humanos que siguen las pautas de investigación aplicables y cumplen con las leyes de Quebec, Canadá.
1. Preparación celular
<ol><li>Descongelar las células mononucleares de sangre periférica humana congelada (PBMC) inmediatamente colocando el criovial en un baño de agua a 37 oC durante 5 min.<...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

El protocolo experimental y los métodos presentados permiten el mdPCR interno utilizando un generador de gotas TPE fabricado, un ciclor térmico y un microscopio de fluorescencia. El dispositivo fabricado que utiliza TPE suave a la unión TPE ofrece propiedades de superficie hidrófoba que son uniformes en todas las paredes del canal, de manera que el dispositivo final no requiere ningún tratamiento superficial para su uso posterior como generador de gotas. Este material se ha empleado rutinariamente en plataformas de ...

El análisis de la composición de los glóbulos blancos (CMB) se encuentra entre las pruebas de laboratorio solicitadas con mayor frecuencia en diagnóstico hematológico. El recuento diferencial de leucocitos sirve como un indicador para un espectro de enfermedades incluyendo infección, inflamación, anemia, y leucemia, y está bajo investigación como un biomarcador de pronóstico temprano para varias otras condiciones, así. El estándar de oro en la subtipificación del CMB implica inmunostaining y/o citometría de flujo, que requieren costosos anticuerpos fluorescentes propensos a la inestabilidad y a menudo dependen en gran medida de la competencia del operador en la preparación de muestras. Además, este método sólo se aplica a muestras de sangre fresca, de forma que las muestras no puedan congelarse para su envío o análisis posteriores.
Los marcadores epigenéticos han surgido recientemente como potentes herramientas analíticas para el estudio de las variaciones fenotípicas. Posteriormente, se ha demostrado que las poblaciones de leucocitos humanos tienen patrones de metilación del ADN del linaje celular que permiten la caracterización precisa de subconjuntos del CMB. El subtipo a base de marcadores epigenéticos proporciona una alternativa prometedora que no depende de la recolección de muestras de sangre fresca o anticuerpos caros y puede ser explotado como un biomarcador para el inicio de la enfermedad y la susceptibilidad1,2,3,4,5.
Se han realizado estudios en todo el genoma para el mapeo extensivo de regiones específicas ricas en CG metiladas en el genoma (islas CpG) en subtipos de leucocitos para identificar marcadores epigenéticos candidatos específicos de subtipos de leucocitos. Los protocolos PCR se han desarrollado debido a esta razón para las regiones genéticas metiladas, por ejemplo, CD3Z y FOXP3, correspondientes a CD3+ células T y CD4+ CD25+ células T reguladoras (T-Regs), respectivamente. Wiencke y otros han demostrado la utilidad de la PCR de gotas dúplex para el subtipado epigenético de células T, produciendo resultados que se correlacionan altamente con el análisis de clasificación celular activada por flujo (FACS)6. Este método de análisis genético cuantitativo se basa en la partición de las moléculas de ácido nucleico de la plantilla y los reactivos de PCR en miles de gotas discretas, definidas volumétricamente, de tamaño subnilóter que contienen cero, una o más copias de ácido nucleico objetivo, utilizando emulsiones de agua en aceite habilitadas por microfluídicos7,,8. La amplificación de PCR se realiza dentro de cada gota individual y se mide la intensidad de fluorescencia final de cada gota, lo que permite la cuantificación absoluta de los objetivos presentes en la muestra. Se ha establecido que la PCR de gotas es más precisa, precisa y técnicamente más simple que la qPCR estándar, lo que lo convierte en un método basado en metilación de ADN más favorable para la evaluación clínica de células T. Aunque se carece de una metodología de subtipado de rápida aparición, se carece de análisis epigenético multiplexado para sondear varias regiones de CpG metiladas simultáneamente. Esto es necesario para los recuentos diferenciales de leucocitos de rutina.
Aquí, se presenta un dispositivo microfluídico de gota de elastómero termoplástico (TPE) y se emplea para la PCR de gota multiplexa específica de metilación (mdPCR). La tecnología se ha utilizado para delinear subtipos específicos de leucocitos, CD3+ células T y CD4+ CD25+ T-Regs, basados en patrones de metilación del ADN de linaje celular, es decir, variación epigenética de las regiones CD3Z y FOXP3 CpG, respectivamente. Un protocolo detallado para la extracción de ADN, la conversión de bisulfito y mdPCR se describe en conjunto con un método de fabricación para un dispositivo de generación de gotas TPE. Los resultados representativos del método se comparan con los de la tinción de inmunofluorescencia que resalta la utilidad del enfoque propuesto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

Se describe un flujo de trabajo de PCR de gotas multiplexadas (mdPCR) y un protocolo detallado para determinar el recuento diferencial de glóbulos blancos basados en epigenéticos (WBC), junto con un dispositivo de generación de gotas microfluídicas de elastómero termoplástico (TPE). Los marcadores epigenéticos se utilizan para la subtipificación del CMB que tiene un importante valor pronóstico en diferentes enfermedades. Esto se logra mediante la cuantificación de los patrones de metilación del ADN de regiones específicas ricas en CG en el genoma (CpG loci). En este artículo, el ADN tratado con bisulfito de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se encapsula en gotas con reactivos mdPCR, incluyendo imprimaciones y sondas fluorescentes de hidrólisis específicas para loci CpG que se correlacionan con subpoblaciones WBC. El enfoque multiplex permite el interrogatorio de muchos loci de CpG sin necesidad de reacciones de mdPCR separadas, lo que permite una determinación paramétrica más precisa de las subpúmedas del CMB mediante el análisis epigenético de sitios de metilación. Esta cuantificación precisa se puede extender a diferentes aplicaciones y destaca los beneficios para el diagnóstico clínico y el pronóstico posterior.

El dispositivo generador de gotas microfluídicas basado en TPE se fabricó utilizando el protocolo descrito como se muestra en la Figura 1. Se utilizó una máscara de transparencia en la fotolitografía para obtener el maestro del silicio (Si). La litografía suave se realizó para obtener una réplica inversa de PDMS del maestro Si que luego se utilizó para fabricar el molde epoxi. El precursor de epoxi se vertió en el PDMS y se curó para reticularse y endurecerse. Este molde, que repr...

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Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Los marcadores epigenéticos se utilizan para la subtipificación de glóbulos blancos (CMB) mediante la cuantificación de los patrones de metilación del ADN. Este protocolo presenta un método de reacción en cadena de la polimerasa de gotas múltiples (mdPCR) utilizando un dispositivo microfluídico basado en elastómero termoplástico (TPE) para la generación de gotas que permite la cuantificación objetivo precisa y múltiplex específica de metilación de los recuentos diferenciales del CMB.

Metilización Específica Multiplex Droplet PCR usando el Dispositivo Generador de Gotas de Polímero para Diagnóstico Hematológico

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Este protocolo presenta un flujo de trabajo pcR de gotas multiplexivas flexible que permite el recuento preciso de leucocitos diferenciales basados en marcadores epigenéticos de metilación. Esta flexibilidad puede facilitar la traducción de mdPCR hacia el uso clínico. Este método proporciona resultados que consultan estrechamente a los obtenidos mediante métodos de tinción inmunofluorescente.Sin embargo, a diferencia de las tinciones inmunofluorescentes, este método no requiere muestras de sangre fresca ni anticuerpos costosos. En el diagnóstico hematológico, el leucocitos diferenciales puede servir como indicadores para un espectro de enfermedades, incluyendo infección, inflamación, anemia y leucemia, y está siendo considerado como un biomarcador de cáncer de pronóstico temprano. Demostrando el procedimiento con Abdelrahman Elmanzalawy estará Christina Nassif, una oficial técnica de nuestro equipo en el Centro de Investigación de Dispositivos Médicos de la NRC.Comience mezclando a fondo 20 microlitros de proteína quinasa K y 400 microlitros de tampón de unión a la lesis que contiene perlas magnéticas con células mononucleares de sangre periférica humana recién descongeladas en 100 microlitros de PBS. Después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, coloque el tubo en un bastidor magnético durante uno o dos minutos antes de retirar el sobrenadante. Con el tubo extraído del imán, vuelva a suspender el complejo de cuentas de ADN en 600 microlitros de tampón de lavado uno para eliminar cualquier perla no específicamente ligada.Coloque el tubo de nuevo sobre el imán para permitir la extracción del sobrenadante, antes de lavar las células en 600 microlitros de tampón de lavado dos como se acaba de demostrar. Después de retirar el sobrenadante, deje que el tubo se seque al aire en el imán durante un minuto antes de agregar 100 microlitros de tampón de elución al tubo con una mezcla completa. A continuación, coloque el tubo en el bastidor magnético durante uno o dos minutos para separar las cuentas magnéticas del ADN aludido, y transfiera la solución de ADN purificado a un nuevo tubo.Para la conversión de bisulfito del ADN purificado, transfiera 20 microlitros de la muestra de ADN aludido a un tubo pcR y agregue 130 microlitros de reactivo de conversión al tubo. Después de una mezcla exhaustiva, gire brevemente hacia abajo el contenido del tubo y amplificar el ADN en un ciclo térmico. Al final del ciclo, agregue 600 microlitros de búfer de unión a una columna de cromatografía iónica colocada en un tubo de recolección y agregue el ADN a la columna.Invierta el tubo varias veces para mezclar y centrifugar durante 30 segundos a toda velocidad. Deseche el flujo recogido a través y agregue 100 microlitros de tampón de lavado a la columna. Centrifugar la columna y desechar el flujo a través de nuevo como se ha demostrado.Añadir 200 microlitros de Desulfonation Buffer a la columna para una incubación de 15 a 20 minutos a temperatura ambiente, antes de centrifugar la muestra y descartar el flujo a través como se ha demostrado. A continuación, lave la columna dos veces con 200 microlitros de tampón de lavado por lavado. Después del segundo lavado, transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección de 1,5 mililitros y agregue 100 microlitros de agua de grado PCR a la membrana de la columna.Luego, eluda el ADN por centrifugación de la columna durante un minuto a toda velocidad. Para la generación de gotas, mezcle un microlitro de ADN convertido en bisulfito con una mezcla maestra de sonda recién preparada en un tubo de PCR y recoja la muestra con una breve centrifugación. Utilice accesorios de pico para conectar tubos fluidos desechables a dos jeringas de vidrio de precisión de volumen de 250 microlitros.Y pre-llenar una jeringa de vidrio de precisión con 250 microlitros de aceite portador que contiene 5%surfactante de harina, y una jeringa de vidrio de precisión con 50 microlitros de aceite portador. Cuando se hayan cargado ambas jeringas, cargue 100 microlitros de la mezcla de PCR en la jeringa de aceite portador y coloque un dispositivo microfluídico de gotas en el escenario de un microscopio de luz vertical equipado con una cámara de alta velocidad. Para la observación y registro de la formación de gotas en tiempo real, coloque las jeringas precargadas en una bomba de jeringa programable y utilice la unión máxima con accesorios para conectar el tubo de las jeringas al tubo de los canales de entrada respectivos del dispositivo microfluídico de gotas.Coloque el tubo desde la salida del generador de gotas hasta el interior de un tubo PCR de 0,5 mililitros, y ajuste el caudal de la bomba de la jeringa a dos microlitros por minuto, para permitir que el tamaño de la gota se estabilice antes de recoger la emulsión resultante. Recoger lentamente y cuidadosamente la emulsión de la parte superior del tubo, y transferir 75 microlitros de la solución a un tubo PCR de 200 microlitros para el ciclo térmico. A continuación, confirme que el contenido de aceite en el tubo pcR coincide estrechamente con el volumen de la fase dispersa, para evitar la carbonescencia de las gotas durante el ciclo térmico, y coloque el tubo de 200 microlitro en el ciclor térmico.Para la imagen por fluorescencia de la muestra emulsionada, transfiera la emulsión PCR a un tubo capilar de borosilicato profundo de 50 micrómetros con un perfil rectangular, para permitir la disposición de las gotas en una monocapa de 50 micras para la toma de imágenes. Después de fijar y sellar los capilares en un portaobjetos del microscopio, cargue el portaobjetos en la etapa del microscopio invertido. Y en el software de imágenes del microscopio, seleccione adquirir y vivir rápido, para iniciar la adquisición de la cámara en tiempo real.A continuación, observe la muestra bajo campo brillante y microscopía de fluorescencia. Después de la generación de gotas y el ciclo térmico, las gotas se pueden introducir en un capilar de vidrio con un ancho de un milímetro y una altura de 50 micrómetros. Para obtener una distribución monocapa de las gotas que es ideal para la adquisición de imágenes de fluorescencia, se pueden grabar imágenes para cada longitud de onda.Después del análisis de la imagen, la intensidad de fluorescencia de todas las gotas en sus respectivos fluoróforos se puede trazar para establecer el umbral de las gotas positivas y negativas. Después de la identificación y el recuento, se pueden calcular las copias por valores de gota, y el porcentaje de células CD3+T, y las células T reguladoras CD4+25+ se pueden determinar en función de las copias metiladas CD3Z y FOXP3 respectivamente, con respecto a las copias por gota del gen total de células o sin C. Los valores porcentuales se pueden comparar con los obtenidos a través de imágenes de inmunofluorescencia utilizando los anticuerpos adecuados.Creo que la estabilidad de la emulsión desde la generación de gotas a través del ciclo térmico y los pasos finales de imagen de gotas es crucial para obtener resultados de cuantificación precisos, fiables y reproducibles. La personalización de MD PCR a través de la formulación de mezcla de PCR personalizada se puede utilizar para una serie de aplicaciones, incluyendo la investigación del cáncer, el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el análisis a nivel de una sola célula.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Investigación

Bioingeniería

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Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

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