Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Författarna erkänner ekonomiskt stöd från National Research Council of Canada.

Alla experiment som utfördes i denna studie med mänskliga prover godkändes av NRC: s etiknämnd och gjordes enligt NRC: s politik som styr mänskliga ämnen som följer tillämpliga forskningsriktlinjer och är förenliga med lagarna i Québec, Kanada.
1. Cellpreparering
<ol><li>Tina de frusna humana perifera blodet mononukleära celler (PBMC) omedelbart genom att placera cryovial i ett vattenbad på 37 °C i 5 min.</li>
	<li>Invertera kryoialen två gånger för att försiktigt resuspend...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

Den presenterade experimentella protokoll och metoder möjliggör in-house mdPCR med hjälp av en fabricerad TPE droplet generator, en termisk cycler och fluorescens mikroskop. Den tillverkade enheten med hjälp av mjuk TPE till TPE bindning ger hydrofoba ytegenskaper som är enhetliga över alla kanalväggar, så att den slutliga enheten inte kräver någon ytbehandling för efterföljande användning som en droppgenerator. Detta material har rutinmässigt anställda i point-of-care plattformar som kräver kompatibilite...

Analys av vita blodkroppar (WBCs) sammansättning är bland de mest efterfrågade laboratorietester i blodsjukdomar diagnostik. Differential leukocyte räkna fungerar som en indikator för ett spektrum av sjukdomar inklusive infektion, inflammation, anemi, och leukemi, och är under utredning som en tidig prognostisk biomarkör för flera andra villkor samt. Guldmyntfot i WBC subtyping innebär immunfärgning och/eller flödescytometri som båda kräver kostsamma, instabilitetsbenägna fluorescerande antikroppar och är ofta mycket beroende av operatörens kompetens vid provberedning. Denna metod är dessutom tillämplig på enbart färska blodprover, så att proverna inte kan frysas för transport eller senare analys.
Epigenetiska markörer har nyligen framträtt som kraftfulla analytiska verktyg för studier av fenotypiska variationer. Därefter har mänskliga leukocyte populationer visat sig ha cell-härstamning DNA metylering mönster som möjliggör den exakta karakterisering av WBC delmängder. Subtypning baserad på epigenetiska markörer ger ett lovande alternativ som inte är beroende av färsk blodprovsinsamling eller dyra antikroppar och kan utnyttjas som en biomarkör för sjukdomsanseringoch mottaglighet 1,2,3,4,5.
Genom-hela studier har utförts för omfattande kartläggning av metylerade specifika CG-rika regioner i arvsmassan (CpG öar) i leukocyte subtyper att identifiera kandidat epigenetiska markörer specifika för leukocyt subtyper. PCR-protokoll har utvecklats på grund av denna orsak till metylerade genregioner, t.ex.+ + + Wiencke et al. har visat nyttan av duplexdropp PCR för epigenetisk subtypning av T-Cells, vilket ger resultat som starkt korrelerar med FLÖDESAKTIVERAD CELLSORTERING (FACS) analys6. Denna kvantitativa genetiska analysmetod bygger på partitionering av mallen nukleinsyra molekyler och PCR reagenser i tusentals diskreta, volymetriskt definierade, sub-nanoliter stora droppar som innehåller noll, en eller flera mål nukleinsyra kopior, med hjälp av vatten-i-olja emulsioner aktiveras av mikrofluidik7,8. PCR-förstärkningen utförs inom varje enskild droppe och ändpunktens fluorescensintensitet för varje droppe mäts, vilket möjliggör absolut kvantifiering av mål som finns i provet. Droplet PCR har fastställts för att vara mer exakt, exakt, och tekniskt enklare än standard qPCR, vilket gör det till en mer gynnsam DNA-metyleringsbaserad metod för klinisk utvärdering av T-Cells. Även om en snabbt framväxande subtyping metod, multiplexed epigenetiska analys att sond för olika metylerade CpG regioner samtidigt saknas. Detta är nödvändigt för rutinmässiga leukocyte differential räknas.
Häri presenteras och anställd för metyleringsspecifik multiplexdroppe PCR (mdPCR) en termoplastisk elastomer (TPE) (TPE). Tekniken har använts för att avgränsa specifika leukocyte subtyper, CD3+ T-Cells och CD4+ CD25+ T-Regs, baserat på cell-härstamning DNA metylering mönster, dvs, epigenetisk variation av CD3Z och FOXP3 CpG regioner, respektive. Ett detaljerat protokoll för DNA-extraktion, bisulfitkonvertering och mdPCR beskrivs i samförstånd med en fabriceringsmetod för en TPE-dropletgenereringsapparat. Representativa resultat av metoden jämförs med de av immunofluorescens färgning belysa nyttan av den föreslagna metoden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

En multiplexed droplet PCR (mdPCR) arbetsflöde och detaljerade protokoll för att fastställa epigenetiska-baserade vita blodkroppar (WBC) differentialantal beskrivs, tillsammans med en termoplastisk elastomer (TPE) mikrofluidic droplet generation enhet. Epigenetiska markörer används för WBC subtyping som är av viktigt prognostiskt värde vid olika sjukdomar. Detta uppnås genom kvantifiering av DNA-metyleringsmönster av specifika CG-rika regioner i arvsmassan (CpG loci). I detta papper är bisulfitbehandlat DNA från mononukleära celler i perifert blod (PBMCs) inkapslat i droppar med mdPCR-reagenser inklusive primrar och hydrolyslysrörssonder som är specifika för CpG loci som korrelerar med WBC-subpopulationer. Multiplex tillvägagångssätt möjliggör förhör av många CpG lokus utan behov av separata mdPCR reaktioner, möjliggör mer exakt parametrisk bestämning av WBC sub-populationer med hjälp av epigenetiska analys av metylering platser. Denna exakta kvantifiering kan utvidgas till olika tillämpningar och belyser fördelarna för klinisk diagnos och efterföljande prognos.

Den TPE-baserade mikrofluidiska droppgeneratoranordningen tillverkades med hjälp av det beskrivna protokollet enligt figur 1. En öppenhet mask användes i fotolitografi för att få kisel (Si) master. Mjuk litografi utfördes för att erhålla en omvänd PDMS replika av Si master som sedan användes för att fabricera epoxi mögel. Epoxi föregångare hälldes på PDMS och botas till crosslink och härda. Denna form, som representerar den exakta kopian av Si master var mer motståndskrafti...

Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Epigenetiska markörer används för undertypning av vita blodkroppar (WBC) genom kvantifiering av DNA-metyleringsmönster. Detta protokoll presenterar en multiplex droplet polymeras kedjereaktion (mdPCR) metod med hjälp av en termoplastisk elastomer (TPE)-baserade microfluidic enhet för droplet generation möjliggör exakt och multiplex metylering-specifika mål kvantifiering av WBC differential räknas.

Metylering Specifik Multiplex Droplet PCR med hjälp av Polymer Droplet Generator Device för hematologiska diagnostik

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Detta protokoll presenterar en flexibel multiplex droplet PCR arbetsflöde som tillåter exakt differentiell leukocyte räkna bygger på epigenetiska metylering markörer. Denna flexibilitet kan underlätta översättningen av mdPCR mot klinisk användning. Denna metod ger resultat som noggrant fråga till dem som erhållits med hjälp av immunofluorescent färgning metoder.Till skillnad från immunofluorescerande färgning, dock, denna metod inte kräver färska blodprov eller kostsamma antikroppar. I blodsjukdomar diagnostik, differential leukocyte kan tjäna som indikatorer för ett spektrum av sjukdomar, inklusive infektion, inflammation, anemi och leukemi, och övervägs som en tidig prognostisk cancer biomarkör. Demonstration av proceduren med Abdelrahman Elmanzalawy kommer att Christina Nassif, en teknisk officer från vårt team på NRC: s Medical Device Research Centre.Börja med att grundligt blanda 20 mikroliter av proteinkinas K och 400 mikroliter av lysbindande buffert som innehåller magnetiska pärlor med nytinad humant perifert blod mononukleära celler i 100 mikroliter av PBS. Efter en fem minuters inkubering i rumstemperatur, placera röret på ett magnetiskt rack i en till två minuter innan du tar bort supernatanten. Med röret bort från magneten, åter upphäva DNA pärla komplex i 600 mikroliter av tvätt buffert en att ta bort alla icke-specifikt bundna pärlor.Placera röret tillbaka på magneten för att möjliggöra avlägsnande av supernatanten, innan du tvättar cellerna i 600 mikroliter av tvättbuffert två som just visats. När du har tagit bort supernatanten, låt röret lufttorka på magneten i en minut innan du lägger till 100 mikroliter elueringsbuffert till röret med grundlig blandning. Placera sedan röret på magnetstället i en till två minuter för att separera de magnetiska pärlorna från det anspelade DNA och överföra den renade DNA-lösningen till ett nytt rör.För bisulfitkonvertering av det renade DNA:t, överför 20 mikroliter av det alluderade DNA-provet till ett PCR-rör, och tillsätt 130 mikroliter omvandlingsreagens till röret. Efter grundlig blandning, kort snurra ner röret innehållet och förstärka DNA på en termisk cycler. I slutet av cykeln, tillsätt 600 mikroliter av bindningsbuffert till en jonkromatografikolonn placerad i ett uppsamlingsrör, och lägg till DNA:t i kolumnen.Invertera röret flera gånger för att blanda, och centrifug i 30 sekunder i full fart. Kassera det insamlade flödet genom, och tillsätt 100 mikroliter av tvättbuffert till kolonnen. Centrifugera kolonnen och kassera genomflödet igen som visats.Tillsätt 200 mikroliter av Desulfonationsbuffert till kolonnen för en inkubering på 15 till 20 minuter vid rumstemperatur, innan provet centrifueras och genomflödet kastas övers. Därefter tvätta kolumnen två gånger med 200 mikroliter tvättbuffert per tvätt. Efter den andra tvätten, överför kolonnen till en ny 1,5 milliliter samlingsrör, och tillsätt 100 mikroliter av PCR-kvalitet vatten till membranet i kolonnen.Sedan, elute DNA genom centrifugering av kolonnen i en minut i full hastighet. För droppgenerering, blanda en mikroliter av bisulfitomconverted DNA med nyberedda probe master mix i ett PCR-rör, och samla in provet med en kort centrifugering. Använd toppbeslag för att koppla engångs fluida slangar till två 250-mikroliter volym precisionsglassprutor.Och förfyll en precisionsglasspruta med 250 mikroliter transportörolja som innehåller 5%flouro-ytaktivt, och en precisionsglasspruta med 50 mikroliter transportörolja. När båda sprutorna har laddats, ladda 100 mikroliter av PCR-mixen i sprutan med transportörolja, och placera en droppe mikrofluidisk enhet på scenen av ett upprätt ljusmikroskop utrustad med en höghastighetskamera. För observation och registrering av droppbildning i realtid, placera de förfyllda sprutorna på en programmerbar sprutpump, och använd Peak Union med beslag för att koppla slangarna på sprutorna till slangarna i droppens mikrofluidiska anordnings respektive inloppskanaler.Placera slangen från utloppet av droppgeneratorn till insidan av en 0,5 milliliter PCR-tub, och justera sprutpumpens flödeshastighet till två mikroliter per minut, så att droppstorleken kan stabiliseras innan den uppsamling av den resulterande emulsionen samlas in. Långsamt och försiktigt samla emulsionen från toppen av röret, och överföra 75 mikroliter av lösningen till en 200 microliter PCR röret för termisk cykling. Sedan, bekräfta att oljehalten i PCR-röret nära matchar volymen av den spridda fasen, för att förhindra kolescens av dropparna under termisk cykling, och placera 200 mikroliterröret i termiska cycler.För fluorescensavbildning av det emulgerade provet, överför PCR-emulsionen till ett 50-mikrometer djupt borosilikt kapillärrör med en rektangulär profil, för att möjliggöra arrangemang av dropparna till ett nära packat monolayer för avbildning. Efter fixering och tätning av kapillärerna på ett mikroskopsglas, ladda bilden på scenen i det inverterade mikroskopet. Och i mikroskopet bildframställning programvara, välj förvärva och leva snabbt, för att starta realtid kamera förvärv.Observera sedan provet under ljust fält och fluorescensmikroskopi. Efter droppgenerering och termisk cykling kan dropparna införas i en glaskambär med en millimeters bredd och en 50-mikrometerhöjd. För att få en monolayerfördelning av dropparna som är idealisk för fluorescensbildanskaffning kan bilder sedan spelas in för varje våglängd.Efter bildanalys kan fluorescensintensiteten hos alla droppar i sina respektive fluoroforer ritas för att fastställa tröskeln för de positiva och negativa dropparna. Efter identifiering och räkning kan kopiorna per droplet-värden beräknas, och andelen CD3+T-celler, och CD4+25+reglerande T-celler kan fastställas baserat på de metylerade CD3Z- respektive FOXP3-kopiorna, med avseende på kopiorna per droppe av de totala cellerna eller C-mindre-genen. Procentvärdena kan sedan jämföras med de som erhålls genom immunofluorescensavbildning med hjälp av de lämpliga antikropparna.Jag tror att emulsion stabilitet från droppen generation genom den termiska cykling och slutliga droppen imaging steg är avgörande för att få exakta, tillförlitliga och reproducerbara kvantifiering resultat. MD PCR anpassning genom skräddarsydda PCR mix formulering kan användas för ett antal tillämpningar inklusive cancerforskning, infektionssjukdomar diagnos och analys på encellsnivå.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Hög genomströmning MikroRNA Profilering: Optimerad Multiplex QRT-PCR vid metod i nanoliter Skala på Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescens detektionsmetoder för mikroflödessystem droppe plattformar

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescens Återhämtning efter Sammanfoga en droppe att mäta de tvådimensionella Spridning av en Phospholipid Mono

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multifluorescensdetektion för dropp Mikrofluidik Använda optiska fibrer

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Cirkulerande MicroRNA Kvantifiering Använda DNA-bindande Dye kemi och Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Magnetisk levitation Tillsammans med Portable Imaging och analys for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimering av en Multiplex RNA-baserade uttryck analysen använder Breast Cancer arkivmaterial

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

En Droplet-baserade mikroflödessystem strategi och Microsphere-PCR-amplifiering för enkelsträngat DNA amplikoner

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensorer att upptäcka proteas aktivitet In Vivo för noninvasiv diagnostik

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...