Name: methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Yazarlar Kanada Ulusal Araştırma Konseyi mali destek kabul.

İnsan örneklerini içeren bu çalışmada yapılan tüm deneyler NRC Etik Kurulu tarafından onaylandı ve NRC'nin yürürlükteki araştırma yönergelerine uygun ve Québec, Kanada'daki yasalara uygun insan deneklerini yöneten politikalarına göre yapıldı.
1. Hücre hazırlama
<ol><li>Dondurulmuş insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) hemen 5 dakika için 37 °C'de bir su banyosunda cryovial yerleştirerek çözültün.</li>
	<li>Hücreleri yavaşça yeniden askıya alm...

<ol>
	<li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+immune+system.">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li><li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases.">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li><li>Su&#225;rez-&#193;lvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., L&#243;pez-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modulation+of+the+immune+function:+A+potential+target+for+tolerance.">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li><li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response.">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li><li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Autoimmune Diseases. , (2014).</li><li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+(mdPCR)+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood.">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics:+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices.">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li><li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+lysis+to+microarray+detection,+an+integrated+thermoplastic+elastomer+(TPE)+point+of+care+Lab+on+a+Disc.">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed,+methylation-specific+digital+droplet+PCR.">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li><li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes.">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li><li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing.">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li></ol>

Sunulan deneysel protokol ve yöntemler, fabrikasyon TPE damlacık jeneratörü, termal çevrimleyici ve floresan mikroskobu kullanarak şirket içi mdPCR'ye olanak sağlar. TPE yapıştırma yumuşak TPE kullanarak fabrikasyon cihaz tüm kanal duvarları boyunca düzgün hidrofobik yüzey özellikleri sağlar, bu nedenle son cihaz bir damlacık jeneratör olarak sonraki kullanım için herhangi bir yüzey işleme gerektirmez. Bu malzeme rutin yüksek iş üretimi9,10,...

Beyaz kan hücreleri (WBCs) bileşiminin analizi hematolojik tanılarda en sık istenen laboratuvar testleri arasındadır. Diferansiyel lökosit sayısı enfeksiyon, inflamasyon, anemi ve lösemi gibi hastalıkların bir spektrum için bir gösterge olarak hizmet vermektedir, ve diğer birçok durum için erken prognostik biyomarker olarak soruşturma altında da. WBC subtyping altın standart immünboyama ve / veya akış sitometri her ikisi de pahalı gerektiren içerir, kararsızlığa eğilimli floresan antikorlar ve genellikle son derece örnek hazırlanmasında operatör yeterlilik bağlıdır. Ayrıca, bu yöntem sadece taze kan örnekleri için geçerlidir, böylece numuneler sevkiyat veya daha sonra analiz için dondurulamaz.
Epigenetik belirteçler son zamanlarda fenotibik varyasyonların incelenmesi için güçlü analitik araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Daha sonra, insan lökosit popülasyonları WBC alt kümelerinin kesin karakterizasyonu için izin hücre soyundan DNA metilasyon desenleri olduğu gösterilmiştir. Epigenetik belirteçlere dayalı subtipleme taze kan örneği toplama veya pahalı antikorlar bağlı değildir ve hastalık başlangıcı ve duyarlılık1,2,,3,4,5için bir biyomarker olarak istismar edilebilir umut verici bir alternatif sağlar.
Lökosit alt tiplerinde genom (CpG adaları) metillenmiş spesifik CG açısından zengin bölgelerin lökosit alt tiplerine özgü aday epigenetik belirteçleri belirlemek için genomda (CpG adaları) kapsamlı haritalama çalışmaları yapılmıştır. PCR protokolleri, cd3+ T-Cells ve CD4+ CD25+ Regulatory T-Cells (T-Regs) ile karşılık gelen metilasyonlu gen bölgeleri, örneğin CD3Z ve FOXP3 için bu nedenle geliştirilmiştir. Wiencke ve ark. T-Hücrelerinin epigenetik subtyping için dupleks damlacık PCR yarar göstermiştir, son derece akış aktif hücre sıralama (FACS)analizi6 ile ilişkili sonuçlar elde . Bu kantitatif genetik analiz yöntemi, şablon nükleik asit molekülleri ve PCR reaktiflerinin mikroakışkanlar tarafından etkin leştirilmiş su-in-oil emülsiyonları kullanılarak sıfır, bir veya daha7,fazla hedef nükleik asit kopyaları içeren binlerce ayrık, hacimsel olarak tanımlanmış, nanolitre altı boyutlu damlacıklara bölünmesinedayanır. PCR amplifikasyon her bir damlacık içinde gerçekleştirilir ve her damlacık uç nokta floresan yoğunluğu ölçülür, örnekmevcut hedeflerin mutlak nicelik sağlar. Damlacık PCR standart qPCR daha hassas, doğru ve teknik olarak basit olarak kurulmuştur, T-Hücrelerinin klinik değerlendirilmesi için daha olumlu bir DNA metilasyon tabanlı yöntem yapma. Hızla ortaya çıkan bir alt tipleme metodolojisi olmasına rağmen, aynı anda çeşitli metillenmiş CpG bölgeleri için araştırmak için çok katlı epigenetik analiz eksiktir. Bu rutin lökosit diferansiyel sayımları için gereklidir.
Burada, bir termoplastik elastomer (TPE) damlacık mikroakışkan cihaz sunulmaktadır ve metilasyona özgü multipleks damlacık PCR (mdPCR) için istihdam. Bu teknoloji, hücre soyundan dna metilasyon desenlerine, yani CD3Z ve FOXP3 CpG bölgelerinin epigenetik varyasyonuna göre spesifik lökosit alt tipleri, CD3+ T-Cells ve CD4+ CD25+ T-Regs'i belirlemek için kullanılmıştır. DNA ekstraksiyonu, bisülfit dönüşümü ve mdPCR için ayrıntılı bir protokol, TPE damlacık üretim cihazı için bir üretim yöntemi ile uyumlu olarak tanımlanmıştır. Yöntemin temsili sonuçları, önerilen yaklaşımın yararını vurgulayan immünoresans boyama sonuçlarıyla karşılaştırılır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>TFI0201</td>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td>
			<td>008-FluoroSurfactant</td>
			<td>Fluoro-surfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MA5-16728</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-8425-71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td></td>
			<td>Used for fluorescence image analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>PCS-800-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ram&#233;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td>
			<td>p/n 200-U1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrocom, NJ, USA</td>
			<td>5015 and 5010</td>
			<td>Borosilicate capilary tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(http://definetherain.org.uk/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>LC-L1V5</td>
			<td>DEL UV light source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200063</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolomite</td>
			<td>3200302</td>
			<td>Disposable fluidic tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Upright light microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV Group, Sch&#228;rding, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D5030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photron, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photoresist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>203603</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Used to assess droplet diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anachemia, Montreal, QC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Broad-spectrum LED fluorescent lamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td>
			<td>DE1010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexpol TPE, &#197;m&#229;l, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Thermoplastic elastomer (TPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>13-400-518</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Used for image acquisition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M, St Paul, MN</td>
			<td></td>
			<td>Carrier Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Blue fluorescent live cell stain (DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEX Health &#38; Science, Oak Harbor, WA</td>
			<td>P-881</td>
			<td>PEEK fittings</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkyUSA, CA, USA</td>
			<td>ARV 310</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ihc world, Maryland, USA</td>
			<td>IW-125-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinsser NA, Northridge, CA</td>
			<td>2607808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetoni GmbH, Korbussen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite</td>
			<td>AA 352</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylation specific multiplex droplet pcr using polymer droplet generator device for hematological diagnostics

Çok katlı damlacık PCR (mdPCR) iş akışı ve epigenetik tabanlı beyaz kan hücresi (WBC) diferansiyel sayımının belirlenmesi için ayrıntılı protokol, termoplastik elastomer (TPE) mikroakışkan damlacık üretim cihazı ile birlikte tanımlanmıştır. Epigenetik belirteçler farklı hastalıklarda önemli prognostik değeri olan WBC subtyping için kullanılır. Bu, genomdaki (CpG loci) belirli CG açısından zengin bölgelerin DNA metilasyon paternlerinin ölçülmesi ile elde edilir. Bu yazıda, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMCs) bisülfit le tedavi DNA' sı, WBC alt popülasyonları ile ilişkili CpG loci'ne özgü astarlar ve hidroliz floresan probları da dahil olmak üzere mdPCR reaktifleri ile damlacıklarda kapsüllenmiştir. Multipleks yaklaşımı, ayrı mdPCR reaksiyonlarına gerek kalmadan birçok CpG loci'nin sorgulanmasını sağlayarak, metilasyon alanlarının epigenetik analizini kullanarak WBC alt popülasyonlarının daha doğru parametrik belirlenmesini sağlar. Bu kesin nicelik farklı uygulamalara genişletilebilir ve klinik tanı ve sonraki prognoz için yararları vurgulamaktadır.

TPE tabanlı mikroakışkan damlacık jeneratör cihazı Şekil 1'degösterildiği gibi açıklanan protokol kullanılarak üretılmıştır. Fotolitografide silikon (Si) ustası elde etmek için saydamlık maskesi kullanılmıştır. Yumuşak litografi daha sonra epoksi kalıp imal etmek için kullanılan Si master ters BIR PDMS kopyasını elde etmek için yapıldı. Epoksi öncül PDMS üzerine dökülür ve çapraz bağlantı ve sertleşmek için tedavi edildi. Si ustasının tam kopyas?...

Watch this Scientific Journal Video about Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics at JoVE.com

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Epigenetik belirteçler beyaz kan hücresi (WBC) DNA metilasyon desenleri nicelik selektib yoluyla subtyping için kullanılır. Bu protokol, WBC diferansiyel sayımlarının hassas ve çok katlı metilasyona özgü hedef nicelemesine olanak sağlayan damlacık üretimi için termoplastik elastomer (TPE) tabanlı mikroakışkan bir cihaz kullanılarak çok katlı damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (mdPCR) yöntemi ni sunar.

Hematolojik Tanı için Polimer Damlacık Jeneratör Cihazı ile Metilasyona Özgü Multipleks Damlacık PCR

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Bu protokol, epigenetik metilasyon belirteçlerine dayalı hassas diferansiyel lökosit sayma sağlayan esnek bir multipleks damlacık PCR iş akışı sunar. Bu esneklik mdPCR'nin klinik kullanıma çevrilmesini kolaylaştırabilir. Bu yöntem, immünofloresan boyama yöntemleri ile elde edilenleri yakından sorgulayan sonuçlar sağlar.Ancak immünofloresan boyamanın aksine, bu yöntem taze kan örnekleri veya pahalı antikorlar gerektirmez. Hematolojik tanıda, diferansiyel lökosit enfeksiyon, inflamasyon, anemi ve lösemi gibi hastalıkların bir spektrum için gösterge olarak hizmet verebilir, ve erken prognostik kanser biyomarker olarak kabul edilmektedir. Abdelrahman Elmanzalawy ile prosedürü gösteren Christina Nassif, NRC Tıbbi Cihaz Araştırma Merkezi'nde ekibimizden bir teknik subay olacaktır.20 mikrolitre protein kiazı K ve 400 mikrolitre lysis bağlayıcı tampon içeren manyetik boncukları içeren 100 mikrolitre PBS'de taze çözülmüş insan periferik kan mononükleer hücreleri ile iyice karıştırarak başlayın. Oda sıcaklığında beş dakikalık bir kuluçka dan sonra, supernatant çıkarmadan önce bir ila iki dakika boyunca bir manyetik raf üzerine tüp yerleştirin. Tüp mıknatıstan çıkarıldığında, 600 mikrolitre yıkama tamponundaki DNA boncuk kompleksini yeniden askıya alarak özel olarak bağlı olmayan boncukları çıkarın.Süpernatant kaldırılmasına izin vermek için mıknatıs üzerine tüp geri yerleştirin, yıkama tampon 600 mikrolitre içinde hücreleri yıkamadan önce iki sadece gösterildiği gibi. Supernatant çıkardıktan sonra, iyice karıştırma ile tüp elüsyon tampon 100 mikrolitre eklemeden önce bir dakika boyunca mıknatıs üzerinde hava-kuru tüp sağlar. Daha sonra, manyetik boncukları ima edilen DNA'dan ayırmak için tüpü manyetik rafa bir ila iki dakika yerleştirin ve saflaştırılmış DNA çözeltisini yeni bir tüpe aktarın.Saflaştırılmış DNA'nın bisülfit dönüşümü için, ima edilen DNA örneğinin 20 mikrolitresini pcr tüpüne aktarın ve tüpe 130 mikrolitre dönüşüm reaktifi ekleyin. Iyice karıştırdıktan sonra, kısaca tüp içeriğini aşağı spin ve bir termal döngü üzerinde DNA yükseltmek. Döngünün sonunda, toplama tüpüne yerleştirilen iyon kromatografisi sütununa 600 mikrolitre bağlama tamponu ekleyin ve DNA'yı kolona ekleyin.Tüpü karıştırmak için birkaç kez ters çevirin ve tam hızda 30 saniye santrifüj yapın. Toplanan akışı atın ve sütuna 100 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Sütunu santrifüj edin ve gösterildiği gibi akışı tekrar atın.Örnek santrifüj ve gösterildiği gibi akış atmadan önce, oda sıcaklığında 15 ila 20 dakikalık bir kuluçka için sütuna 200 mikrolitre Desülfürasyon Tampon ekleyin. Daha sonra, yıkama başına yıkama tampon 200 mikrolitre ile iki kez sütun yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, sütunu yeni bir 1,5 mililitrelik toplama tüpüne aktarın ve sütunun zarına 100 mikrolitre PCR sınıfı su ekleyin.Daha sonra, tam hızda bir dakika için sütun santrifüj tarafından DNA'yı eforuz. Damlacık üretimi için, bir mikrolitre bisülfit dönüştürülmüş DNA ile pcr tüpünde yeni hazırlanmış prob ana karışımını karıştırın ve numuneyi kısa bir santrifüjle toplayın. Tek kullanımlık akışkan boruları iki adet 250 mikrolitrelik hacimhassas cam şırıngasına bağlamak için tepe bağlantı parçaları kullanın.Ve bir hassas cam şırıngasını %5 flouro yüzey aktif madde içeren 250 mikrolitre taşıyıcı yağ ve 50 mikrolitre taşıyıcı yağ içeren hassas cam şırıngaile önceden doldurun. Şırıngaların her ikisi de yüklendiğinde, 100 mikrolitre PCR karışımını taşıyıcı yağşın şırıngasına yükleyin ve yüksek hızlı kamerayla donatılmış dik ışık mikroskobunun aşamasına bir damlacık mikroakışkan cihaz yerleştirin. Damlacık oluşumunun gerçek zamanlı olarak gözlemi ve kaydı için, önceden doldurulmuş şırıngaları programlanabilir bir şırınga pompasına yerleştirin ve şırıngaların borularını damlacık mikroakışkan cihazın ilgili giriş kanallarının borularına bağlamak için bağlantı parçalarıyla pik birliğini kullanın.Damlacık jeneratörünün çıkışından 0,5 mililitrelik PCR tüpün içine boru yerleştirin ve elde edilen emülsiyon toplamadan önce damlacık boyutunun stabilize olmasını sağlamak için şırınga pompası akış hızını dakikada iki mikrolitreye ayarlayın. Yavaş ve dikkatli bir şekilde tüpün üstünden emülsiyon toplamak ve termal bisiklet için 200 mikrolitre PCR tüp için çözeltinin 75 mikrolitre aktarın. Daha sonra, PCR tüpündeki yağ içeriğinin, termal bisiklet sırasında damlacıkların birleşmesini önlemek ve 200 mikrolitrelik tüpü termal döngüye yerleştirmek için dağılmış fazın hacmiyle yakından eşleştiğini onaylayın.Emülsifiye numunenin floresan görüntülemesi için, pcr emülsiyonunu dikdörtgen profilli 50 mikrometre derinliğindeki borosilikat kapiller tüpe aktarın, böylece damlacıkların görüntüleme için yakın bir paketlenmiş tek katmanlı olarak düzenlenmesine izin verin. Kılcal damarları mikroskop slaytına sabitleyip mühürledikten sonra, slaytı ters mikroskop aşamasına yükleyin. Ve mikroskop görüntüleme yazılımı, seçin satın almak ve hızlı yaşamak, gerçek zamanlı kamera edinimi başlatmak için.Daha sonra, parlak alan ve floresan mikroskopi altında örnek gözlemleyin. Damlacık üretimi ve termal bisiklet sonrasında, damlacıklar bir milimetre genişliği ve 50 mikrometre yüksekliği ile cam bir kılcal içine girişlenebilir. Floresan görüntü edinimi için ideal olan damlacıkların tek katmanlı dağılımını elde etmek için, görüntüler her dalga boyu için kaydedilebilir.Görüntü analizinden sonra, kendi floresanlarındaki tüm damlacıkların floresan yoğunluğu, pozitif ve negatif damlacıkların eşiğini belirlemek için çizilebilir. Tanımlama ve sayımdan sonra, damlacık değerleri başına kopyalar hesaplanabilir ve CD3+T-hücrelerinin yüzdesi ve CD4+25+düzenleyici T-hücrelerinin yüzdesi, toplam hücre veya C-az genin damlacık başına kopyalarına göre sırasıyla metillenmiş CD3Z ve FOXP3 kopyalarına göre belirlenebilir. Yüzde değerleri daha sonra uygun antikorlar kullanılarak immünoresans görüntüleme yoluyla elde edilenlerle karşılaştırılabilir.Ben termal bisiklet ve son damlacık görüntüleme adımları ile damlacık nesil emülsiyon istikrar hassas, güvenilir ve tekrarlanabilir nicelik selektif sonuçlar elde etmek için çok önemli olduğunu düşünüyorum. Özel PCR karışım formülasyonu ile MD PCR özelleştirme, tek hücre düzeyinde kanser araştırmaları, bulaşıcı hastalık teşhisi ve analitik gibi bir dizi uygulama için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Hastalık Teşhis için Taşınabilir Görüntüleme ve Analiz ile birleştiğinde Manyetik Levitasyonunun

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Meme kanseri arşivleme malzeme kullanarak bir Multiplex RNA temel ifade tahlil duruma getirilmesi

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Bir damlacık dayalı mikrosıvısal yaklaşım ve Microsphere-PCR güçlendirme tek iplikçikli DNA'Amplicons için

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors için noninvaziv tanı koyma proteaz aktivitesi Vivo tespit

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...