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August 11th, 2020
DOI :
August 11th, 2020
•0:04
Introduction
0:48
Atomic Force Microscopy (AFM)
4:32
Confocal Microscopy
6:42
Clean Up
7:14
Results: Representative Conpokal Live Cell Imaging
8:43
Conclusion
Transcript
Conpokal नमूना सतह प्रहार करने के लिए एक जांच का उपयोग कर परमाणु बल माइक्रोस्कोपी के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है । यद्यपि दोनों तकनीकें व्यक्तिगत रूप से प्रभावी हैं, कॉन्पोकल यांत्रिक लक्षण वर्णन के साथ फ्लोरेसेंस सह-स्थानीयकरण की सुविधा प्रदान करती है। कोंपोकल तकनीक का मुख्य लाभ, निकट एक साथ दोहरी-माइक्रोस्कोपी है।
कन्फोकल एएफएम जांच से पहले और बाद में साइटोस्केलेटल और अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच करता है, जो क्षेत्र विशिष्ट यांत्रिक गुणों को वितरित करता है। यह तकनीक मशीनोबायोलॉजी क्षेत्र के भीतर प्रभावशाली है उदाहरण के लिए, मस्तिष्क की कोशिकाओं को शारीरिक परिस्थितियों में विद्युत आवेगों और बल लेनदेन की जांच करने के लिए जांच की जा सकती है। विश्लेषण शुरू करने से पहले, वांछित डेटा संग्रह के लिए एक उपयुक्त एएफएम कैंटिलीवर का चयन करें और दस्ताने, एएफएम चिप बढ़ते चरण, चिमटी, और ग्लास ब्लॉक में चिप माउंट करने के लिए एक छोटा पेचकश का उपयोग करें।
ध्यान से एएफएम चिप को ग्लास ब्लॉक के केंद्र पर रखें। कैंटिलीवर प्लस एएफएम चिप का एक बहुत छोटा सा हिस्सा ग्लास ब्लॉक के दृश्यमान, गैर-अपारदर्शी हिस्से में होना चाहिए। पेंच कसने के लिए पेचकश का उपयोग करें जब तक चिप ग्लास ब्लॉक के खिलाफ सुखद है, और एक लेंस का उपयोग करने के लिए जांच है कि चिप सही ढंग से उन्मुख है ।
जब चिप को ठीक से उन्मुख किया गया हो, तो ग्लास ब्लॉक को उचित अभिविन्यास में एएफएम हेड में रखें और ग्लास ब्लॉक को जगह में लॉक करें। उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा अंशांकन पकवान के नीचे का पता लगाने के बाद, एएफएम सिस्टम जेड स्टेपर मोटर नियंत्रण कक्ष का उपयोग करने के लिए नमूने के ऊपर AFM कैंटिलीवर २००० माइक्रोन ले जाने के लिए । उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी और जेड स्टेपर मोटर नियंत्रण कक्ष का उपयोग करना, पेट्री डिश में एएफएम टिप को दुर्घटनाग्रस्त करने से बचने के लिए 100 से 200 माइक्रोन के चरणों में ग्लास डिश के नीचे एएफएम चिप को धीरे-धीरे कम करें।
उपकरण मंच पर एक्स वाई या एएफएम सिर की सादे गति में नियंत्रित करने वाले मैनुअल माइक्रोमीटर का पता लगाएं। एएफएम कैंटिलीवर से छाया गहरा हो जाती है, और आकार तेज हो जाता है, एएफएम सिर को सही करने और देखने के क्षेत्र के भीतर एएफएम कैंटिलीवर की स्थिति को समायोजित करने के लिए मैनुअल माइक्रोमीटर का उपयोग करें। इस समय, लुकअप टेबल को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर व्यू में दिखाई देने के लिए एक छाया के लिए देखें, जो इंगित करता है कि एएफएम टिप डिश के नीचे के करीब हो रही है। जब तक टिप ज्यादातर फोकस में न हो, तब तक एएफएम टिप को कम करने के लिए छोटे चरणों का उपयोग जारी रखें। जब लेजर स्थिति में है, जहां AFM टिप कैंटिलीवर पर स्थित है की पीठ पर लेजर स्थिति के लिए लेजर संरेखण डायल का उपयोग करें ।
लेजर संरेखण पैनल शून्य वोल्ट से अधिक एक राशि संकेत प्रदर्शित करना चाहिए। लेजर, AFM कैंटिलीवर पर दिशाओं के सभी में एक छोटी सी दूरी ले जाएँ, जब तक अधिकतम राशि संकेत प्राप्त किया है, जबकि AFM टिप पर शेष है । एक बार लेजर स्थिति सेट हो जाने के बाद, ऊर्ध्वाधर और पार्श्व विक्षेप को शून्य करने के लिए मैन्युअल रूप से नियंत्रित विक्षेप डायल का उपयोग करें।
डिटेक्टर को संरेखित करने के लिए ऊर्ध्वाधर और पार्श्व विक्षेप घुंडी का उपयोग करें ताकि लक्ष्य केंद्रित हो और लेजर संरेखण पैनल में कोई ऊर्ध्वाधर या पार्श्व विक्षेप मनाया न जाए। अंशांकन खिड़की खोलें, और सभी प्रयोगों विशिष्ट जानकारी दर्ज करें। लेजर लाइट फिल्टर को बदलें।
अंशांकन से पहले, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोत को बंद करें और कमरे के प्रकाश या कंपन से आने वाले किसी भी संभावित शोर को गीला करने के लिए एएफएम बाड़े को बंद करें। सिस्टम को टिप को कैलिब्रेट करने की अनुमति देने के लिए अंशांकन बटन दबाएं। अंशांकन पूरा होने पर कैंटिलीवर की कठोरता और उसकी संवेदनशीलता अंशांकन पैनल में प्रदर्शित होगी।
फिर स्कैनिंग शुरू करने के लिए प्ले बटन दबाने से पहले, नमूना डिश के नीचे टिप को कम करने के लिए स्वचालित दृष्टिकोण कमांड बटन का उपयोग करें और स्कैनिंग शुरू करने के लिए प्ले बटन दबाने से पहले त्वचा क्षेत्र, संकल्प, सेट पॉइंट, जेड लंबाई और पिक्सेल समय का आकार सेट करें। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप इमेजिंग के लिए, कॉन्फोकल क्षमताओं को सक्षम करें और नमूनों को दाग देने के लिए उपयोग किए जाने वाले रंगों के लिए उपयुक्त लेजर लाइनों का चयन करें। नमूने में उन सुविधाओं को उत्तेजित और छवि बनाने के लिए एक या कई लेजर लाइनों का चयन करें और लाभ को एक मूल्य पर सेट करें जो नमूना फ्लोरेसेंस को अनुकूलित करता है लेकिन शोर की मात्रा को सीमित करता है।
गतिशील रेंज को अधिकतम करते हुए संतृप्त पिक्सेल से बचने के लिए लेजर पावर को समायोजित करें और ऑप्टिकल सेक्शनिंग के लिए संकल्प को अधिकतम करने के लिए पिनहोल आकार को एक क्षेत्र इकाई में सेट करें। यदि आवश्यक हो, तो नमूना चमक के आधार पर मूल्यों को समायोजित करें। पिक्सेल निवास समय निर्धारित करने के लिए, लगभग दो माइक्रोसेकंड निवास समय के साथ शुरू करें, और आवश्यकतानुसार नमूना चमक को प्रतिबिंबित करने के लिए समायोजित करें।
चयनित उद्देश्य के लिए पिक्सेल आकार का चयन करने के लिए, साधन Nyquist विकल्प बटन और छवि में पिक्सेल की चयनित संख्या के माध्यम से पिक्सेल आकार की गणना करते हैं । इसके बाद, स्कैन विकल्प का चयन करें और डेटा संग्रह शुरू करें। अपने स्पष्ट रूप में नमूनों सुविधाओं का प्रतिनिधित्व फोकल विमान का पता लगाने के लिए फोकस घुंडी का उपयोग करें, स्कैन बटन डेटा संग्रह शुरू करने के लिए, और एक दो आयामी छवि पर कब्जा करने के लिए कैप्चर बटन ।
पैनल का उपयोग करना जो Nyquist विकल्प के माध्यम से पिक्सेल आकार को नियंत्रित करता है, स्कैन के क्षेत्र आकार को कम करने के लिए केवल एक ही सेल आवरण । संग्रह उपकरण को सक्रिय करें और नीचे से शीर्ष विकल्प का उपयोग करें, केवल लेजर लाइन के साथ जो नमूने में एक सुविधा को सबसे स्पष्ट रूप से रोशन करता है, विमानों के बीच सुझाए गए अंतर का उपयोग करके मापा जाने वाली मात्रा के लिए स्टार्ट और फिनिश विमानों को सेट करें। फाइल का नाम लें और इसे संबंधित फोल्डर में सेव करें।
वैकल्पिक रूप से, यदि नमूनों की मोटाई का हमारा प्राथमिकताओं का ज्ञान मौजूद है, तो मात्रा को परिभाषित करने के लिए ध्यान को समायोजित करके प्रतिभाशाली, तेज, मध्य विमान का चयन करें और मध्य विमान के ऊपर नमूना मोटाई रखने के लिए शीर्ष सेट करें, और नीचे मध्य विमान के नीचे मोटाई रखने के लिए, फिर उचित चरण आकार का चयन करें। रन नाउ बटन दबाकर अधिग्रहण चलाएं। जब अधिग्रहण खत्म हो जाता है, तो फ़ाइल को उचित फ़ोल्डर पर सहेजें।
प्रयोग के अंत में, ग्लास ब्लॉक को हटाते समय दस्ताने पहनें और इसे बढ़ते स्टेशन में रखें। एएफएम चिप को ध्यान से हटाने के लिए रबर पकड़ता के साथ चिमटी का उपयोग करें और उपयोग किए गए टिप को स्टोरेज बॉक्स के स्थान पर वापस रखें जो यह दर्शाता है कि इसका उपयोग किया गया है। भविष्य के संदर्भ के लिए, ध्यान दें कि प्रयोग में कौन सी टिप का उपयोग किया गया था।
यहां, एक प्रतिनिधि एएफएम एक जीवित एचईके सेल पर स्कैन करता है। इस विशेष एचईके सेल के लिए ऊंचाई लगभग 10 माइक्रोन थी जैसा कि लाइन स्कैन द्वारा प्रदर्शित किया गया था। यहां, एक अनुचित AFM टिप विकल्प के कारण एक गरीब स्कैन का एक उदाहरण देखा जा सकता है ।
इस छवि में, काले पिक्सल सेल के शीर्ष पर दिखाई दिया जो यह दर्शाता है कि एएफएम पीए जोन एक बड़ी सेल ऊंचाई के कारण सीमा से बाहर था। एएफएम कैंटिलीवर का अंत भी छवि में दिखाई देता है क्योंकि टिप ऑफसेट सेल ऊंचाई की तुलना में अपर्याप्त टिप ऊंचाई के साथ संयुक्त होता है। AFM छवि में इन कलाकृतियों, संकेत मिलता है कि एक अलग AFM टिप सेल छवि के लिए चुना जाना चाहिए था ।
तीन रंग कॉन्फोकल इमेजिंग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सेल नाभिक, माइक्रो ट्यूबल, और लिपोफिलिक झिल्ली की कल्पना करना। नैनो मैकेनिकल मॉडल के संयोजन में टिप इंडेंटेशन का विश्लेषण, सतह के मॉड्यूलस मानचित्र की पीढ़ी को अनुमति देता है।
यहां, लेजर कॉन्फोकल जेड स्टैक का एक संबंधित 3डी प्रक्षेपण दिखाया गया है। एएफएम स्कैन और मापा मॉड्यूलस नक्शे भी रोगाणुओं के लिए प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन जीवाणु के इन प्रतिनिधि विश्लेषण में मनाया । जैसा कि प्रदर्शन किया गया है, पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में एएफएम के साथ इस पैमाने पर एक बेहतर संकल्प प्राप्त किया जा सकता है।
चिपकने वाला बल मानचित्रण आणविक बातचीत की कल्पना करने के लिए conpokal के माध्यम से किया जाने वाला एक तकनीक है। उदाहरण के लिए, बाध्यकारी गतिज का निरीक्षण करने के लिए कोशिका सतह अणुओं के मॉड्यूलेशन का अध्ययन करना। Conpokal चिकित्सा माइक्रोबायोलॉजी में संरचना समारोह संबंधों की खोज के लिए एक नए मार्ग में प्रवेश ।
उदाहरण के लिए, भौतिक और रासायनिक घटनाओं और पेप्टिडोगलाइकन परत, एंटीबायोटिक प्रतिरोध से जोड़ा जा सकता है ।
यहां प्रस्तुत कोंपोकल तकनीक का प्रोटोकॉल है, जो कॉन्फोकल और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी को एक ही साधन मंच में जोड़ती है। Conpokal एक ही सेल, एक ही क्षेत्र, एक साथ कंफोकल इमेजिंग और जीवित जैविक नमूनों के यांत्रिक लक्षण वर्णन के पास प्रदान करता है ।
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