6.4K Views
•
09:20 min
•
August 11th, 2020
DOI :
August 11th, 2020
•0:04
Introduction
0:48
Atomic Force Microscopy (AFM)
4:32
Confocal Microscopy
6:42
Clean Up
7:14
Results: Representative Conpokal Live Cell Imaging
8:43
Conclusion
Transcript
Conpokal kombinerar konfokalmikroskopi med atomkraftmikroskopi med hjälp av en sond för att peta provytan. Även om båda teknikerna är effektiva individuellt, underlättar Conpokal fluorescens samlokalisering med mekanisk karakterisering. Den största fördelen med Conpokal tekniken, är den nära samtidiga dual-mikroskopi.
Confocal undersöker cytoskeletal och andra cellulära processer före och efter AFM-probing, som levererar områdesspecifika mekaniska egenskaper. Denna teknik är slagkraftig inom mekanobiologi fältet som till exempel, kan hjärnceller vara sonderade under fysiologiska förhållanden för att undersöka elektriska impulser och kraft transaktion. Innan du påbörjar analysen, välj en lämplig AFM cantilever för önskad datainsamling och använda handskar, AFM chip monteringssteget, pincett, och en liten skruvmejsel för att montera chip i glasblocket.
Placera försiktigt AFM-chipet på mitten av glasblocket. Den cantilever plus en mycket liten del av AFM chip bör vara i den synliga, icke-ogenomskinlig del av glasblocket. Använd skruvmejseln för att dra åt skruven tills chippet är tätt mot glasblocket, och använd en lins för att kontrollera att chipet är orienterat korrekt.
När chipet har varit ordentligt orienterad, placera glasblocket i AFM huvudet i rätt orientering och låsa glasblocket på plats. Efter att ha lokaliserat botten av kalibreringsfatet genom ljusfältsmikroskopi, använd AFM-systemet Z stegmotor kontrollpanel för att flytta AFM cantilever 2000 mikrometer ovanför provet. Med hjälp av ljust fältbelysning och Z stegmotorn kontrollpanelen, sänk långsamt AFM chip till botten av glasfatet i steg på 100 till 200 mikrometer för att undvika att krascha AFM-spetsen i Petri-skålen.
Leta reda på de manuella mikrometrar som styr X Y eller i vanlig rörelse hos AFM-huvudet på instrumentplattformen. När skuggan från AFM cantilever blir mörkare, och formen blir skarpare, använd de manuella mikrometrar för att korrigera AFM huvudet och justera placeringen av AFM cantilever inom synfältet. För tillfället kan uppslagstabellerna behöva justeras.
Titta på en skugga som ska visas i mikroskopet programvara vy, vilket tyder på att AFM spets närmar sig botten av skålen. Fortsätt använda små steg för att sänka AFM-tipset tills spetsen är mestadels i fokus. När lasern är i position, använd laserjusteringsratten för att placera lasern på baksidan av där AFM-spetsen sitter på cantilever.
Laserjusteringspanelen bör visa en summasignal större än noll volt. Flytta lasern, ett litet avstånd i alla riktningar på AFM cantilever, tills den maximala summan signal uppnås samtidigt som den kvar vid AFM spets. När laserpositionen är inställd, använd de manuellt styrda avböjningsratten för att nolla den vertikala och laterala avböjningen.
Använd de vertikala och laterala avböjningsvredarna för att rikta in detektorn så att målet är centrerat och det inte finns någon vertikal eller lateral avböjning som observerats i laserjusteringspanelen. Öppna fönstret Kalibrering, och ange alla de experiment specifik information. Byt ut laserljusfiltret.
Innan du kalibrerar, stäng av den konfokala mikroskop ljuskällan och stäng AFM-höljet för att dämpa eventuella ljud som kommer från rummet ljus eller vibrationer. Tryck på knappen Kalibrering för att automatiskt låta systemet kalibrera spetsen. När kalibreringen är klar kommer styvheten hos cantilever och dess känslighet att visas i panelen Kalibrering.
Använd sedan knappen Automated Approach Command för att sänka spetsen till undersidan av provskålen och ställ in storleken på hudområdet, upplösningen, börpunkten, Z-längden och pixeltiden, innan du trycker på uppspelningsknappen för att börja skanna. För konfokalmikroskopavbildning i mikroskopprogramvaran, aktivera konfokalkapaciteten och välj de laserlinjer som är lämpliga för de färgämnen som användes för att färga proverna. Välj en eller flera laserlinjer för att excitera och avbilda dessa funktioner i provet och ställ in förstärkningen till ett värde som optimerar provfluorescensen men begränsar mängden brus.
Justera lasereffekten för att undvika mättade pixlar samtidigt som du maximerar det dynamiska omfånget och ställer in hålstorleken på en områdesenhet för att maximera upplösningen för den optiska snittningen. Om det behövs justerar du värdena baserat på provljusstyrkan. Om du vill ställa in pixelhällstiden börjar du med ungefär två mikrosekunds uppehållstid och justerar för att återspegla provljusstyrkan efter behov.
Om du vill välja pixelstorlek för den valda målsättningen låter du instrumentet beräkna pixelstorleken via alternativknappen Nyquist och det valda antalet pixlar i bilden. Därefter väljer du alternativet Skanna och påbörjar datainsamlingen. Använd fokusratten för att lokalisera fokalplanet som representerar samples-funktionerna i dess tydligaste form, knappen Skanna för att påbörja datainsamlingen och knappen Fånga för att fånga en tvådimensionell bild.
Med hjälp av panelen som styr pixelstorleken via nyquistalternativet minskar du storlek på sökningen till att bara omsluta en enda cell. Aktivera insamlingsverktyget och använd ett alternativ från undersidan till topp, med endast den laserlinje som lyser upp en funktion i provet tydligast, ställ in start- och målplanen för den volym som ska mätas med hjälp av det föreslagna avståndet mellan planen. Namnge filen och spara den i den associerade mappen.
Alternativt, om vår förkunskap om prov tjocklek finns, välj den ljusaste, skarpaste, mittplan genom att justera fokus för att definiera volymen och ställa in toppen för att ha provet tjocklek ovanför mitten planet, och botten för att ha tjockleken under mitten planet, välj sedan lämplig stegstorlek. Kör förvärvet genom att trycka på knappen Kör nu. När anskaffningen är klar sparar du filen i lämplig mapp.
I slutet av experimentet, använd handskar medan du tar bort glasblocket och placerar det i monteringsstationen. Använd pincett med gummigrepp för att försiktigt ta bort AFM-chipet och placera tillbaka den använda spetsen på förvaringslådans plats som är orienterad vid åtkomst till betecknar att den har använts. För framtida referens, notera vilket tips som användes i experimentet.
Här visas en representativ AFM-skanning över en levande HEK-cell. Höjden för just denna HEK-cell var runt 10 mikrometer som framgår av linjen scan. Här kan ett exempel på en dålig skanning på grund av en felaktig AFM tips val observeras.
I den här bilden, svarta pixlar dök upp vid toppen av cellen som anger att AFM PA zonen var utanför intervallet på grund av en stor cellhöjd. Slutet av AFM cantilever visas också i bilden på grund av spetsen offset kombinerat med en otillräcklig spetshöjd jämfört med cellhöjden. Dessa artefakter i AFM bilden, visar att en annan AFM spets borde ha valts för att avbilda cellen.
Tre färg confocal imaging kan utföras. Till exempel, för att visualisera cellkärnan, mikro tubuli, och lipofila membran. Analys av spetsen indrag i kombination med nano mekanisk modell, möjliggör generering av en modulus karta över ytan.
Här visas en motsvarande 3D-projektion av laserkonfokal Z-stacken. AFM-skanningar och uppmätta moduluskartor kan också förvärvas för mikrober, vilket observeras i dessa representativa analyser av streptokocker mutans bakterie. Som visats, kan en bättre upplösning uppnås i denna skala med AFM, än med traditionell konfokalmikroskopi.
Vidhäftande kraftkartläggning är en teknik som utförs genom conpokal för att visualisera molekylära interaktioner. Till exempel, att studera moduleringen av cellytan molekyler att observera bindande kinetik. Conpokal inleder en ny väg för att utforska strukturfunktionsrelationer inom medicinsk mikrobiologi.
Till exempel, fysiska och kemiska händelser och det peptidoglykana lagret, kan kopplas till antibiotikaresistens.
Presenteras här är protokollet i Conpokal tekniken, som kombinerar confocal och atomkraft mikroskopi till ett enda instrument plattform. Conpokal ger samma cell, samma region, nära samtidig konfokal avbildning och mekanisk karakterisering av levande biologiska prover.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved