Name: near simultaneous laser scanning confocal and atomic force microscopy (conpokal) on live cells
Uploaded: 2020-08-11T13:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells at JoVE.com

P20GM130456 numarası altında NIH COBRE finansmanını kabul ediyoruz. Araştırmadan Sorumlu Başkan Yardımcısı tarafından desteklenen Birleşik Krallık Işık Mikroskobu Çekirdeği'ne bu çalışmadaki yardımları için teşekkür ederiz. S. mutans ve E. faecalis suşları Dr Natalia Korotkova tarafından sağlanmıştır. Conpokal' ın confokal mikroskopi ve atomik kuvvet mikroskobu kombinasyonunu tanımlamak için ilk kez kentucky Üniversitesi' nden Dr. Brad Berron' a atfedilir.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Mikro-veya nano ölçekli mekanik değerlendirme araçları genellikle tek hücre veya mikroorganizma düzeyindeki deformasyon özelliklerini ortaya çıkarmak için kullanılırken, hücre altı süreçleri ve yapısal özellikleri görselleştirmek için ayrı yüksek çözünürlüklü mikroskopi araçları kullanılmaktadır. Conpokal, lazer tarama konfokal mikroskopi ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tek bir enstrümantal platform içine kombinasyonudur. Conpokal tekniği ilk olarak biyolojik olmayan bir polimer sistemde uygulanmıştır ve amaç yumuşak yüzeylerle temas eden sert yüzeylerin yapışmasını, elastikiyeti ve yüzey gerilimini belirlemektir. Konfokal görüntüler polimer deforme nasıl görsel bir render sağlanan, yapışır, ve sert prob bültenleri1,2. Polimerlerden biyolojik numunelere kadar bu teknik, yakın eşzamanlı canlı hücre veya mikroorganizma konfokal görüntüleme ve AFM için fırsat sağlar.
Hücre elastikiyetindeki değişiklikler birçok insan hastalığının patogenezinde meydana gelmiştir.3 vasküler bozukluklar da dahil olmak üzere4Sıtma5,6, orak hücreli anemi7Artrit8Astım9, ve kanser6,10,11,12,13,14,15. Hücrelerin mekaniğini ölçmek için ortak teknikler manyetik boncuk kullanımı içerir16,17, optik cımbız18,19, mikropipet aspirasyonu8,20,21,22ve AFM11,23,24,25,26. AFM'nin canlı hücrelere uygulanmasından bu yana hücre topografyasını karakterize etmek için kolayca uyarlanmıştır.27,28 yanı sıra mekanik özellikleri11,24,29,30,31 nano ölçekli hassasiyetle. AFM mikroromatoloji için daha fazla adapte edilmiştir32,33, frekans modülasyonu34,35, ve sürünme25,36,37 çeşitli hücre hatlarının viskoelastik özelliklerini incelemek için deneyler. Uygun bir nanocontact modelinin kullanımı, AFM tarafından üretilen kuvvet girintisi ölçümlerinden nicel elastikiyet değerlerinin çıkarılması için çok önemlidir.1,2. Sitoskeletel ilaçların hücre elastikiyeti üzerindeki etkisini araştıran AFM çalışmaları elastik modülün yüksek oranda etkilendiğini göstermiştir.38. Elastik modül ölçümlerine dayanarak, birçok araştırmacı kanserli hücrelerin dönüşümsüz benzerlerinden daha yumuşak olduğunu göstermiştir.11,38,39. Artmış deformeedilebilirlik muhtemelen kanser hücrelerinin metastaz ve dokulara infiltrasyon yeteneği önemli bir rol oynar40. Bu tür davranışlar hücrelerin sitosiskelet organizasyonundaki değişikliklerle düzenlenir.38,41,42. Kansere ek olarak, mekanik bağımlı hastalıkların başka bir sınıf solunum hastalıkları vardır. Örneğin, akut solunum stres sendromu her yıl daha fazla insan etkiler. Hastalar yüksek oksijen konsantrasyonları ile mekanik ventilasyona konulduğunda durumlarının daha da kötüleşebileceği gösterilmiştir.43. AFM ile alveoler epitel makrofajları gözlemleyen bir dizi çalışmada, bilim adamları oksijen açısından zengin bir ortamın eklenmesinin aktin oluşumuna bağlı hücrelerin sertliğini artırdığını buldular; AFM'nin hücresel düzeyde solunum fonksiyonu üzerindeki atmosferik çevresel etkiyi ve nihayetinde insan iyileşmesi ve sağlığı üzerindeki detaylı anlayışımız üzerindeki etkisinin önemli bir örneği44,45,46. Bir yaraya doğru geçiş sırasında epitel hücre sertliği de AFM ile değerlendirilebilir ve gelecekteki hücre yayılma sinyali elastik modül bir varyasyon oluşur47,48. Bu nedenle, hastalıklı hücrelerin sağlıklı hücrelerden nasıl farklı olduğunu ve onlarla nasıl etkileşimde bulunduklarını anlamak için hücre mekaniğini nicel olarak ölçmeye pratik bir ihtiyaç vardır.
AFM ayrıca yapışkan özellikleri ve yüzey yapısını incelemek için de kullanılır. Bir atomik kuvvet mikroskobu, temas mekaniği kullanan bir örnek hakkında bilgi toplamak için çeşitli modlara sahiptir. Yaşayan biyolojik numuneler için, birincil hedeflerden ikisi, harita yüzey yüksekliğinin yanı sıra nicel mekanik özellik değerlerini(örn.elastik modüler, yapışkan kuvvetler) elde etmektir. Bu modlar, sabit bir sapma yı korumak için sabit bir sapma49'uyükselten veya düşüren numune yüzeyi ve temas moduyla aralıklı olarak temas eden sabit bir kantilever genliğini koruyan dokunma modunu (aralıklı temas olarak da bilinir) içerir. Yapışma haritaları AFM sisteminde kuvvet haritalama kullanılarak toplanabilir. Kantilever örneği belirli bir kuvvete indeneder ve sonra geri çekilir. Geri çekilmeye direnen kuvvet dedektör tarafından ölçülür ve bir kuvvet yer değiştirme grafiği oluşturur. Yapışma kuvveti geri çekme sırasında ölçülen maksimum kuvvettir. Yüzey morfolojisi, numunenin mikro veya nano düzeyde ayrıntılı bir görünümünü sağlar. Kantilever, her pikseldeki kantilin hareketi tarafından yakalanan girinti ve sapmaya dayanarak numune üzerinde bir raster tetkikini tamamlar ve mikro ve nano boyutlu özellikleri ortaya çıkarır. AFM ile peptidoglikan yapısı50, polimer zincir hizalama51, flagella52, lamellipodia53ve filipodia54 gibi küçük özelliklerin boyutu ölçülebilir. AFM'nin gücü kuvvet yer değiştirme eğrileri ve optik olmayan topolojik görüntülerde yer alırken, konfokal mikroskopi floresan etiketli örneklerin ayrıntılı görüntülerini sunar.
Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) canlı hücreleri, sabit hücreleri ve dokuları görüntüleme için baskın bir tekniktir55,56,57. CLSM 1955 yılından bu yana biyolojik görüntüleme için istihdam edilmiştir yani,kuruluşundan bu yana58,59. Konfokal mikroskopların çalışma prensibi(yani,bir iğne deliği aracılığıyla odak ışığı nın reddi) büyük ölçüde aynı kalırken, teknik uygulama çok çeşitli hale gelmiştir56,57,58,60. Confocal görüntüleme çok noktalı tarama yoluyla uygulanabilir, dönen disk sistemi gibi61, tek bir lazer ışını nokta tarama, çizgi taramagibi 62, veya bir çok eleman dedektörü ile sonraki piksel reassignments ile nokta yayma fonksiyonu görüntüleme57. Konfokal görüntüleme nin yarar genişletmek Son gelişmeler lazer tarama yeteneği, yüksek hızlı rezonans tarama ve yüksek hassasiyet dedektörleri63,64,65içerir. Tüm konfokal sistemlerin geniş alan mikroskoplarına göre sahip olmasının avantajı, z ekseninde optik kesitlemeyi daha ayrıntılı olarak, özellikle kalın örneklerde gerçekleştirebilme yeteneğidir. Kamera tabanlı algılama kullanan geniş alan mikroskopları, odak düzleminden yayılan ışığı ve aynı anda aydınlatma yolunun her yerinden yayılan ışığı toplar. İğne deliğini kapatarak, sinyalin azaltılması pahasına, hem eksenel hem de yanal çözünürlükartırılabilir 66. CLSM'de, uyarma lazeri x-y görüş alanında taranırken, görüntüler emisyon sinyali toplama yoluyla piksel piksel olarak oluşturulur. Örneğin z ekseni boyunca birkaç x-y düzlemlerinin toplanması daha sonra örnek57,673 boyutlu mimarisini yeniden oluşturmak için kullanılabilir. Konfokal mikroskopi ile birlikte floresan proteinlerin tanıtılması, hücre biyolojisi anlayışımızda devrim yarattı68. Örneğin, nörolojik69önemli bir araç haline gelmiştir. CLSM düzenli olarak temizlenmiş doku gözlemlemek için kullanılır, ve bağışıklık lekeli beyin ve nöronal ağ mimarisi nin kapsamlı görüntüleri elde etmek için70. Bu uygulama beyinde nöronlar ve glial hücreler arasında sinaptik temas ve iletişim içine yeni anlayışlar sonuçlandı71. Beyin hücrelerinden veziküllere kadar floresan boyama protokolleri, tedavi tekniklerindeki ilerlemeler için konfokal mikroskopi yoluyla hücre fonksiyonlarının incelenmesini ve yakalanmasını destekler72,73.
Etkileyici ve çok yönlü araçlar ayrı ayrı olmalarına rağmen, konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu (Conpokal) kombinasyonu, araştırmacıların çeşitli hücresel organellerin ve ilgili dinamiklerinin gözlemi ile topografik ve mikromekanik hücresel/doku özelliklerini benzersiz bir şekilde ilişkilendirmelerine olanak tanır. Eşleştirilmiş enstrümantasyon, kullanıcıların aslında neyi araştırdıklarını "görmelerini" sağlar; kendi başına bir teknik üzerinde büyük bir avantaj. Conpokal ile, AFM ile kuvvet haritalama hücre sertliği, yapışma veya morfolojiörnek içinde sitoskelet yapısı, örneğin ilişkilendirmek için konfokal görüntüler üzerine kaplanır. Conpokal yönteminin genel amacı, araştırmacıların canlı örnekleri özlü ve etkili bir şekilde incelemeleri için bir platform sağlamak ve hem görüntü hem de malzeme özellik verilerini tek bir platformda sağlamaktır. Bu çalışmada, uygun numune seçimi ve hazırlanması, cihaz kurulumu, cantilever kalibrasyonu dahil olmak üzere Conpokal'ın işleyişini göstermekte ve başarılı sorun giderme yönergeleri sayılmaktadır. Protokolden sonra, başarılı bakteri ve hücre AFM yükseklik haritalama, bakteri ve hücre AFM modülü haritalama ve aynı hücre konfokal ve AFM ile çok etiketli hücrelerin konfokal görüntüleme dahil temsili sonuçlar sağlar. Conpokal yordamı kritik adımları, sorun giderme önerileri, teknik sınırlamaları, önemi ve yöntemiçin gelecekteki görünüm bir tartışma ile sona erer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acoustic Enclosure</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Acoustic Enclosure</td>
			<td>Chamber used to mitigate noise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCT142</td>
			<td>Used to label microtubules in mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP-qp-CONT-BSG AFM tips</td>
			<td>NanoAndMore</td>
			<td>CP-qp-CONT-BSG-B</td>
			<td>Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td>Used to label plasma membrane of mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRL0100-0500</td>
			<td>Component of cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1285601</td>
			<td>Used to simulate biological environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>45000-736</td>
			<td>Component of cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Component of bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 nucleic acid stain</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293 cells</td>
			<td>ATCC Global Bioresource Center</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Mammalian cells used in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47743-716</td>
			<td>Coating in cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PFQNM-LC-A-CAL</td>
			<td>AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoWizard 4a</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>NanoWizard 4a</td>
			<td>AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1 HD25</td>
			<td>Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PENICILLIN/STREPTOMYCIN</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16777-164</td>
			<td>Component of cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>Maintains desired Petri dish sample temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qp-BioAC-Cl AFM tips</td>
			<td>Nanosensors</td>
			<td>qp-BioAC-Cl-10</td>
			<td>Three different AFM cantilevers of varying stiffness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>5051</td>
			<td>Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt Broth Bacto</td>
			<td>BD DIFCO Bacterius Ltd</td>
			<td>Bacto-249240</td>
			<td>Component of bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin, BODIPY FL Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V34850</td>
			<td>Used to fluorescently label bacterial cell wall</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

near simultaneous laser scanning confocal and atomic force microscopy (conpokal) on live cells

Mikro ve nano ölçekli mekanik karakterizasyon için mevcut teknikler son birkaç on yıl içinde patladı. Tarama ve iletim elektron mikroskobunun daha da geliştirilmesinden, atomik kuvvet mikroskobunun icadından floresan görüntülemedeki gelişmelere kadar, küçük malzemelerin incelenmesine olanak sağlayan teknolojilerde önemli kazanımlar elde edilmiştir. Conpokal, konfokal mikroskopi ile atomik kuvvet mikroskobu (AFM) birleştirir ve bir sonda nın yüzeyi "dürttüğü" bir portmanteaudur. Her teknik kendi nitel ve/veya nicel görüntü koleksiyonu için son derece etkili olmasına rağmen, Conpokal harmanlanmış floresan görüntüleme ve mekanik karakterizasyon ile test etme olanağı sağlar. Yakın eşzamanlı konfokal görüntüleme ve atomik kuvvet sondajı için tasarlanan Conpokal, canlı mikrobiyolojik numuneler üzerinde deneyler ilerler. Eşleştirilmiş enstrümantasyondan elde edilen ek bilgiler, ölçülen mekanik özelliklerin(örn.elastik modül, yapışma, yüzey pürüzlülüğü) AFM tarafından hücre altı bileşenler veya konfokal mikroskopi ile gözlemlenebilecek aktivite ile birlikte lokalizasyonunu sağlar. Bu çalışma, aynı anda, aynı hücre, aynı bölge, konfokal görüntüleme ve mekanik karakterizasyon elde etmek için, lazer tarama konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu çalışması için adım protokol sağlar.

Conpokal tekniği Şekil 1A'da şematik olarak gösterilir ve kurulumun görüntüsü Şekil 1B'degösterilmiştir. Konfokal mikroskopi ile biyolojik yapıların AFM'de aynı yapılarla doğru bir şekilde bir araya gelmek için, kurulum sırasında iki sistemin hizalanması çok önemlidir. Birbirlerinin mekansal gereksinimlerine aşina saygın konfokal ve AFM üreticilerini seçin. Ayrıca, tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması iyi boyama prosedürleri, biyolojik yapının immobilizasyonu ve AFM ipucu uygun seçim dayanır. Canlı hücrelerin yüksekliği genellikle AFM görüntüleme için bir sorun teşkil etmektedir. Yaşayan bir HEK hücresi üzerinde AFM tkişişekil 2A'dagösterilmiştir. Bu hek hücresinin yüksekliği yeşil çizgi tonu ile gösterilen 10 μm civarındaydı(Şekil 2B). Sıfır ofset (uç kantilever in en ucunda) veya hücre yüksekliği(örneğin,uç yüksekliği ≥ 10 μm) daha büyük bir AFM ucu tek tek hücrelerin son derece çözülmüş bir görüntü üretecektir. Uygun olmayan AFM uç seçimi nedeniyle kötü tarama örneği Şekil 2C'yedahildir. Bu resimde, afm piezo büyük bir hücre yüksekliği nedeniyle kapsama alanı dışında olduğunu belirten hücrenin en sonunda siyah pikseller belirdi. AFM kantilinin ucu, hücre yüksekliğine kıyasla yetersiz uç yüksekliğiyle birleşen uç ofset nedeniyle görüntüde (yuvarlak bir kare) belirdi. AFM görüntüdeki bu yapılar, hücreyi görüntülemek için farklı bir AFM ucu seçilmesi gerektiğini gösterir.
Bu yöntem için floresan boyamada etkin etiketleme ve canlı hücre görüntülemesi için doğru prob gereklidir. Şekil 3A'da gösterilen üç renkli konfokal görüntüyü nükleer bir leke (floresan mavi), mikrotübül lekesi (floresan yeşil) ve lipophilic membran lekesi (floresan kırmızı) ile gerçekleştirdik. Bu canlı hücre sondaları sınırlı spektral çakışma ve standart filtre küpleri ile uyumluluk nedeniyle seçildi. Ayrıca Şekil 3B'yebrightfield optik görüntüsünü de dahil ettik.
AFM itibaren, bir nanomekanik model ile birlikte uç girintileri analizi, yüzey bir modül haritası üretir. Şekil 4A'da hücre şeklinin 3Boyutlu rekonstrüksiyonuna (Şekil 3'tegösterilen iki hücre) hertz model fit ve parabolik profil (yarıçap 8 nm) kullanılarak oluşturulmuş bir modül haritası örneği gösterilmiştir. Lazer konfokal z yığınının karşılık gelen 3B projeksiyonu Şekil 4B'degösterilmiştir.
Bu yöntem, mikro ve nanoskobik özellikleri ışık mikroskobu kullanılarak çözülmesi zor olan tek bakteriler de dahil olmak üzere daha küçük biyolojik yapılar için de uygundur. Devam eden bir çalışmada Streptococcus mutans.74 Hücre duvarı bileşenlerinin manipülasyonu morfolojisi ve antibiyotik direnci değişikliklere neden hücre duvarı içinde antibiyotik direnci etkileyen mekanik mekanizmaları keşfetmek için Conpokal tekniği kullanır. Conpokal, hücre duvarı bileşenlerinin varlığı veya yokluğu ile aynı hücre örneklerinde canlı, in-solution, veri toplamayı(örn.yüzey morfolojisi, elastik modül, yapışma mukavemeti ve yüzey pürüzlülüğü) çift mekanik özelliklere kolaylaştırır. Şekil 5A,B, Streptococcus mutans bakterisinin AFM tkişive ölçülen modül haritasını içerir. Bu ölçekte AFM ile geleneksel konfokal mikroskopiye göre daha iyi çözünürlük elde edilmiştir.
Şekil 6, hücre duvarına takılan yeşil floresan hücre yapısı lekesi ile boyanmış Enterococcus faecalis kolonisinin konfokal görüntüsünü içerir. Şekil 5 ve Şekil 6, Ökaryotik hücrelere ek olarak Conpokal tekniğinin mikroplara uygulanabilirliğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig01.jpg"> Şekil 1: Conpokal kurulumu. (A) Conpokal tekniği şeması. (B) Alet kurulumunun görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig02.jpg"> Şekil 2: Canlı hücrelerin atomik kuvvet mikroskobu. (A) İki HEK hücresinin AFM görüntüsü. (B) Bir HEK hücresinin yükseklik profili (A'daki yeşil çizgi) hücre yüksekliğinin 10 μm'de oldukça büyük olduğunu gösterir. (C) AFM piezo hücrenin apeks aralığında olduğu bir astrosit hücrenin zayıf AFM görüntüsü ve cantilever sonunda ters görüntüleme kanıtıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig03.jpg"> Şekil 3: Canlı hücrelerin konfokal ve brightfield mikroskobu. (A)Nükleer bir leke (floresan mavi), mikrotübül lekesi (floresan yeşil) ve lipophilic membran lekesi (floresan kırmızı) ile boyanmış yaşayan HEK hücrelerinin lazer tarama konfokal mikroskobu. (B) Karşılık gelen brightfield optik görüntü. Kireç çubukları 10 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig04.jpg"> Şekil 4: AFM'nin 3Boyutlu görüntülemelerinin ve yaşayan HEK hücrelerinin konfokal mikroskopisinin karşılaştırılması. (A) Modül haritası, AFM'den hücrenin 3Boyutlu rekonstrüksiyonuna kaplanmış uç şekli için Hertz modeli fit ve parabolik profil (8 nm yarıçapı) kullanılarak oluşturulmuştur. (B) Nükleer bir leke (floresan mavi), mikrotübül lekesi (floresan yeşil) ve lipophilic membran lekesi (floresan kırmızı) ile lazer konfokal z yığınıkarşılık gelen 3D projeksiyon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig05.jpg"> Şekil 5: Bakteri örneğinin AFM'si. (A) AFM tkişi ve (B) ölçülen bir Streptococcus mutans bakterisinin modül haritası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig06.jpg"> Şekil 6: Bakteri örneğinin konfokal mikroskopisi. Yeşil floresan membran lekeile Enterococcus faecalis bir koloni konfokal görüntü. Ölçek çubuğu 5 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells at JoVE.com

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Burada konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu tek bir enstrüman platformu nda birleştiren Conpokal tekniğinin protokolü sunulmuştur. Conpokal aynı hücre, aynı bölge, eşzamanlı konfokal görüntüleme ve canlı biyolojik örneklerin mekanik karakterizasyonu yakın sağlar.

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Conpokal, örnek yüzeyini dürtmek için bir sonda kullanarak konfokal mikroskopi ile atomik kuvvet mikroskobu yla birleştirir. Her iki teknik de bireysel olarak etkili olmasına rağmen, Conpokal mekanik karakterizasyon ile floresan ko-lokalizasyonu kolaylaştırır. Conpokal tekniğinin en büyük avantajı, yakın eşzamanlı çift mikroskopi olduğunu.Konfokal, alana özgü mekanik özellikler sağlayan AFM sondası öncesi ve sonrası sitoskeletve diğer hücresel süreçleri inceler. Bu teknik, örneğin, beyin hücreleri elektriksel impulslar ve kuvvet hareketi incelemek için fizyolojik koşullar altında incelenmiş olabilir gibi mekanobiyoloji alanında etkili. Analize başlamadan önce, istenilen veri toplama için uygun bir AFM kantili seçin ve eldiven, AFM yonga montaj aşaması, cımbız ve talaşı cam bloğa monte etmek için küçük bir tornavida kullanın.AFM çipini cam bloğun ortasına dikkatlice yerleştirin. Cantilever artı AFM çipçok küçük bir kısmı cam bloğun görünür, opak olmayan kısmında olmalıdır. Talaş cam blok karşı rahat olana kadar vida sıkmak için tornavida kullanın ve çip doğru odaklı olup olmadığını kontrol etmek için bir lens kullanın.Talaş düzgün bir şekilde yönlendirildiğinde, cam bloğu AFM kafasına uygun yönde yerleştirin ve cam bloğu yerine kilitleyin. Kalibrasyon kabının alt kısmını parlak alan mikroskobu yla tespit ettikten sonra, AFM cantilever 2000 mikronlarını numunenin üzerine taşımak için AFM sistemi Z step motor kontrol panelini kullanın. Parlak alan aydınlatması ve Z step motor kontrol paneli kullanarak, AFM ucunu Petri kabına çarpmamak için AFM çipini 100 ila 200 mikron arasında cam kabın dibine kadar yavaşça indirin.X Y'yi kontrol eden manuel mikrometreleri veya AFM kafasının düz harekethalinde cihaz platformunda bulun. AFM'nin gölgesi karardınve şekil keskinleştikçe, AFM kafasını düzeltmek ve AFM cantilever'in görüş alanı içindeki konumunu ayarlamak için manuel mikrometreleri kullanın. Şu anda, arama tablolarının ayarlanması gerekebilir.AFM ucunun yemeğin altına yaklaştığını gösteren mikroskop yazılımı görünümünde bir gölgenin görünmesini izleyin. Uç çoğunlukla odak ta ki AFM ucunu düşürmek için küçük adımlar kullanmaya devam edin. Lazer konumalırken, lazer hizalama kadranlarını kullanarak lazeri afm ucunun bulunduğu yerin arka tarafına yerleştirin.Lazer hizalama paneli sıfır volttan daha büyük bir toplam sinyali göstermelidir. AFM ucunda kalırken maksimum toplam sinyali elde edilene kadar lazeri, AFM kantilinin tüm yönlerinde küçük bir mesafeyi hareket ettirin. Lazer konumu ayarlandıktan sonra, dikey ve yanal sapma sıfır manuel olarak kontrol sapma kadranları kullanın.Hedefin ortalanması ve lazer hizalama panelinde dikey veya yanal sapma olmaması için dedektörü hizalamak için dikey ve yanal sapma düğümlerini kullanın. Kalibrasyon penceresini açın ve tüm deneylere özel bilgileri girin. Lazer ışık filtresini değiştirin.Kalibre etmeden önce, konfokal mikroskop ışık kaynağını kapatın ve oda ışık veya titreşimlerinden kaynaklanan olası gürültüyü azaltmak için AFM kasasını kapatın. Sistemin ucu otomatik olarak kalibre etmesine izin vermek için Kalibrasyon düğmesine basın. Kalibrasyon tamamlandığında, kantilever sertliği ve hassasiyeti Kalibrasyon panelinde görüntülenir.Ardından, tarama başlatma düğmesine basmadan önce, ipucunu örnek yemeğin altına düşürmek ve cilt alanının boyutunu, çözünürlüğü, ayar noktasını, Z uzunluğunu ve piksel süresini ayarlamak için Otomatik Yaklaşım Komutu düğmesini kullanın. Mikroskop yazılımında konfokal mikroskop görüntülemeiçin konfokal yetenekleri etkinleştirin ve numuneleri lekelemek için kullanılan boyalara uygun lazer çizgilerini seçin. Örnekteki bu özellikleri heyecanlandırmak ve görüntülemek için bir veya birden çok lazer çizgisi seçin ve kazancı örnek floresanını optimize eden ancak gürültü miktarını sınırlayan bir değere ayarlayın.Dinamik aralığı en üst düzeye çıkarırken doymuş pikselleri önlemek için lazer gücünü ayarlayın ve optik kesit çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için iğne deliği boyutunu bir alan birimine ayarlayın. Gerekirse, değerleri örnek parlaklığına göre ayarlayın. Piksel çalışma süresini ayarlamak için yaklaşık iki mikrosaniyelik bir yaşam süresiyle başlayın ve gerektiğinde örnek parlaklığını yansıtacak şekilde ayarlayın.Seçili hedef için piksel boyutunu seçmek için, enstrümanın Nyquist seçeneği düğmesi ve görüntüdeki seçilen piksel sayısını kullanarak piksel boyutunu hesaplamasına izin verin. Ardından, Tscan seçeneğini seçin ve veri toplamaya başlayın. Örnek özelliklerini en net formunda temsil eden odak düzlemini, veri toplamaya başlamak için Scan düğmesini ve iki boyutlu bir görüntü yakalamak için Yakalama düğmesini bulmak için odak düğmesini kullanın.Nyquist seçeneği ile piksel boyutunu kontrol eden paneli kullanarak, yalnızca tek bir hücreyi saran tarar'ın alan boyutunu küçültün. Toplama aracını etkinleştirin ve yalnızca örnekteki bir özelliği en net şekilde aydınlatan lazer çizgisiyle altseçeneğini kullanarak, düzlemler arasında önerilen boşluk kullanılarak ölçülecek ses düzeyi için başlangıç ve bitiş düzlemlerini ayarlayın. Dosyayı adlandırın ve ilişkili klasöre kaydedin.Alternatif olarak, numune kalınlığı hakkındaki priori bilgimiz varsa, sesi tanımlamak için odağı ayarlayarak en parlak, en keskin, orta düzlemi seçin ve orta düzlemin üzerinde örnek kalınlığına sahip olacak şekilde üst kısmı, orta düzlemin altındaki kalınlığa sahip alt kısmı ayarlayın, ardından uygun adım boyutunu seçin. Şimdi Çalıştır düğmesine basarak satın almayı çalıştırın. Edinme bittiğinde, dosyayı uygun klasöre kaydedin.Deneyin sonunda, cam bloğu çıkarırken eldiven giyin ve montaj istasyonuna yerleştirin. AFM çipini dikkatlice çıkarmak için kauçuk kulplu cımbız kullanın ve kullanılmış ucu, kullanıldığını belirtmek için erişimkapalı olarak yönlendirilen depolama kutusunun konumuna geri yerleştirin. İleride başvuru için, denemede hangi ipucunun kullanıldığını not edin.Burada, yaşayan bir HEK hücresi üzerinde temsili bir AFM tonu gösterilir. Bu hek hücresinin yüksekliği, hat tararcının gösterdiği gibi yaklaşık 10 mikron civarındaydı. Burada, uygun olmayan bir AFM ipucu seçimi nedeniyle kötü bir tarama örneği görülebilir.Bu resimde, afm PA bölgesinin büyük hücre yüksekliği nedeniyle kapsama alanı dışında olduğunu gösteren hücrenin en tepesinde siyah pikseller belirdi. AFM kantilinin ucu, hücre yüksekliğine göre yetersiz uç yüksekliğiyle birleşen uç ofset nedeniyle görüntüde de görünür. AFM görüntüdeki bu yapılar, hücreyi görüntülemek için farklı bir AFM ipucunun seçilmesi gerektiğini gösterir.Üç renk konfokal görüntüleme yapılabilir. Örneğin, hücre çekirdeğini, mikro tübülleri ve lipophilic membranı görselleştirmek için. Nano mekanik model ile birlikte uç girintilerinin analizi, yüzeyin bir modül haritası nın üretimine olanak sağlar.Burada lazer konfokal Z yığınının karşılık gelen 3Boyutlu projeksiyonu gösterilmiştir. Streptococcus mutans bakterisinin bu temsili analizinde gözlendiği gibi, AFM taramaları ve ölçülen modül haritaları mikroplar için de elde edilebilir. Gösterildiği gibi, geleneksel konfokal mikroskopi ile daha iyi bir çözünürlük AFM ile bu ölçekte elde edilebilir.Yapıştırıcı kuvvet haritalama moleküler etkileşimleri görselleştirmek için conpokal ile yapılan bir tekniktir. Örneğin, bağlayıcı kinetik gözlemlemek için hücre yüzey moleküllerinin modülasyon çalışma. Conpokal, tıbbi mikrobiyolojide yapı fonksiyon ilişkilerini keşfetmek için yeni bir yol açmaktadır.Örneğin, fiziksel ve kimyasal olaylar ve peptidoglikan tabakası, antibiyotik direnci ile bağlantılı olabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-rate Tarama Konfokal Mikroskop ve Mikroendoskopi

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Eğik tarama Lazer Ophthalmoscopy (oSLO) ve optik koherens tomografi (OCT) tarafından Multimodal hacimsel Retina Görüntüleme

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...