Name: super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يشكرا إدواردو ميكوتي على انتقاده البناء للمخطوطة. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل BrightFocus A2019296F، من قبل فوندو دي Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC)، من قبل Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) ومن قبل شبكة التدريب المبتكرة ماري Skłodowska-Curie (JK).

1- الثقافات الأساسية
<ol><li>الثقافة الماوس فرس النهر الخلايا العصبية الأولية في أغطية الغرف (مثل ibidi μ-الشريحة 8 Well أو Nunc Lab-Tek Coverglass) التي تتطابق مع الشرط الموضوعي لسمك الغطاء #1.5 (0.17 مم).</li>
	<li>يغطي معطف مع 100 ميكرولتر من بولي-L-ليسين (100 ميكروغرام/مل).</li>
	<li>في اليوم التالي، غسل الأغطية الغرف مرتين ...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).</li><li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Synapse.">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation.">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li><li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System.">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy.">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).</li><li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy:+The+Treachery+of+Images.">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li><li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+diffraction+limit.">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).</li><li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+super-resolution.">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathy:+dysfunction+of+synaptic+function.">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li><li>Tyebji, S., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptopathic+mechanisms+of+neurodegeneration+and+dementia:+Insights+from+Huntington's+disease.">Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease.</a> Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).</li><li>Won, H., Mah, W., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorder+causes,+mechanisms,+and+treatments:+focus+on+neuronal+synapses.">Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+State+of+Synapses+in+Fragile+X+Syndrome.">The State of Synapses in Fragile X Syndrome.</a> The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).</li><li>Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+major+synaptic+signaling+pathways+involved+in+intellectual+disability.">Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability.</a> Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).</li><li>Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+prion+diseases:+a+trafficking+problem.">Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem.</a> International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).</li><li>Colnaghi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+Resolution+Microscopy+of+SUMO+Proteins+in+Neurons.">Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., M&#246;nkem&#246;ller, V., Hennig, S., H&#252;bner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ.">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy:+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach.">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li><li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoJ-SQUIRREL:+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts.">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images.">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander&#8217;s+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander&#8217;s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+neurodegenerative+diseases.">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li><li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide.">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li><li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases:+a+proteomic+approach.">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li><li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila.">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li></ol>

إن توضيح بنية وتكوين المشبك أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات الفسيولوجية والمرضية التي تنظم الذاكرة والإدراك. بينما في الحالة الطبيعية، نقاط الاشتباك العصبي هي لبنات بناء الذاكرة، كما أنها تكمن وراء الاضطرابات العصبية المعقدة مثل مرض الزهايمر32. البروتوكول الموصوف هنا يعمل ع?...

وقد تغير فهم وعرض المشبك بشكل كبير منذ وصفه الأول من قبل فوستر وشيرينغتون في 18971. ومنذ ذلك الحين، معرفتنا الاتصالات العصبية والعمليات الجزيئية وراء ذلك نمت أضعافامضاعفة 2. أصبح من الواضح أنه يمكن التفكير في نقاط الاشتباك العصبي كنظام حجرتين: حجرة ما قبل متشابك تحتوي على حويصلات للافراج عن الناقلات العصبية وحجرة ما بعد متشابك مع مستقبلات3. وقد تطورت هذه النظرة التبسيطية، في السنوات العشرين الماضية، إلى شبكة معقدة من البروتينات المطلوبة لتحويل الإرسال إلى إشارة4.
المكاسب في فهم جزئيا بسبب تقنيات فائقة الدقة التي تغلبت على الحد الأقصى للحجم المجهري الضوئي التقليدي لتتناسب مع البعد من نقاط الاشتباك العصبي أفضل5،6،7،8،9،10. بسبب الحد من الانعراج ، لا يمكن للمجهر البصري أن يصل إلى قرار فوق 200 نانومتر11،12. لتجاوز هذا الحد، تم إنشاء تقنيات فائقة الدقة، وذلك باستخدام نهج مختلفة والوصول إلى مختلف القرارات الحد من الحيود الفرعي: SIM، STED (المجهر استنفاد الانبعاثات المحفزة)، النخيل (PhotoActivated التعريب المجهري) و STORM (المجهر إعادة الإعمار البصرية العشوائية)13،14. تُضاعف SIM الدقة المكانية لأنظمة المجهر واسعة النطاق القائمة على الليزر عن طريق إدخال صرّار حيود في مسار شعاع الإثارة15. diffracts صر المنقولة أشعة الليزر لخلق نمط الإضاءة المعروفة، وعادة المشارب. يتم فرض هذا النمط من الضوء المنظم عن قصد إلى التوزيع المكاني غير معروف للصبغة الفلورية (من العينة). هامش التداخل التي شكلتها نمطين ترميز لتفاصيل دقيقة لا يمكن تحديدها خلاف ذلك مع المجهر العادي واسعة المجال. يتم الحصول على الصورة النهائية الفائقة من خلال الجمع بين وفك مع الأساليب الرياضية عدة صور خام من نفس العينة التي تم الحصول عليها من خلال ترجمات وتناوب الصريف الحيود. قرار فائقة حل الصور تصل إلى 100 نانومتر في الجانبي و 500 نانومتر في الاتجاهات المحورية ل2D-SIM15 أو 100 نانومتر في الجانبي و 250 نانومتر في الاتجاهات المحورية ل3D-SIM16.
الفهم الجديد للمشابك هو أكثر أهمية في ضوء العديد من الاضطرابات العصبية حيث خلل متشابك يلعب دورا رئيسيا في بداية وتقدم17,18. مرض الزهايمر، متلازمة داون، مرض باركنسون، أمراض البريون، الصرع، اضطرابات طيف التوحد ومتلازمة X الهشة من بين أمور أخرى قد تم ربطها بتشوهات في التركيب متشابك، مورفولوجيا وظيفة19،20،21،22.
في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام مجموعة من الأجسام المضادة سومو محددة، استخدمنا سيم لإظهار التعريب المشترك في الخلايا العصبية فرس النهر الأولية من البروتينات سومو مع علامات ما قبل وما بعد متشابك سينابتوفيسين و PSD95 على مستوى فائقة الدقة23. هذا مكننا من تأكيد الأدلة المجهرية الحيوية والمجهرية الميكولوجية لتوطين سومو في الخلايا العصبية.
هنا، ونحن وصف بروتوكول لدراسة توطين البروتينات في الخلايا العصبية الأولية فرس النهر الماوس. في الوقت نفسه، قد يتم تكييف هذا البروتوكول مع أنواع مختلفة من الثقافات العصبية الأولية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue solution&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody SENP1</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-271360</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 Supplement</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >17504044</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >21115</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chambered coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DyLight</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Hyclone)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>SH3007002 (CHA1111L)</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &#956;m, yellow&#8211;green fluorescent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8803</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >G8769</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td>H3537</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Cystein&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MAP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB15452</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM&#160;</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >21575022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl</td>
			<td >Merck Life Science</td>
			<td >M8266</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaOH</td>
			<td >VWR International</td>
			<td>1,091,371,000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal A</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10888022</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-SIM Super Resolution Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Papain</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td >P-3125</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep 10x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PSD95&#160;</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>K28/43</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round coverglass</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12052712</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUMO1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32058</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptophysin&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5768&#160;</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td >Merck Life Science&#160;</td>
			<td>T9003-500MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging to study co-localization of proteins and synaptic markers in primary neurons

نقاط الاشتباك العصبي هي العناصر الوظيفية للخلايا العصبية وعيوبها أو خسائرها هي في أساس العديد من الاضطرابات العصبية والعصبية. وتستخدم على نطاق واسع دراسات التصوير للتحقيق في وظيفتها واللدونية في الظروف الفسيولوجية والمرضية. بسبب حجمها وهيكلها، تتطلب دراسات توطين البروتينات تقنيات تصوير عالية الدقة. في هذا البروتوكول، نحن وصف إجراء لدراسة في الخلايا العصبية الأولية التعريب المشترك للبروتينات المستهدفة مع علامات متشابك على مستوى فائقة الدقة باستخدام المجهر الإضاءة منظم (SIM). SIM هي تقنية إضاءة منقوشة تعمل على مضاعفة الدقة المكانية للمجهر الواسع، لتصل إلى تفاصيل تبلغ حوالي 100 نانومتر. يشير البروتوكول إلى عناصر التحكم والإعدادات المطلوبة لإجراء دراسات قوية للترجمة المشتركة ونظرة عامة على الأساليب الإحصائية لتحليل بيانات التصوير بشكل صحيح.

نحن نقدم هنا سير العمل القياسية لدراسة البروتينات العصبية شارك في التعريب. قمنا أولاً بمعايرة المجهر وبعد ذلك قمنا بإجراء تحليل SIM للعينات. لمعايرة النظام، استخدمنا الفلورسنت microspheres من 0.1 ميكرومتر القطر. عند الحصول على صور 3D-SIM فائقة الحل من الخرز ، فإن بيانات الصورة الأساسية هي فورييه - تح?...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons at JoVE.com

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

هذا البروتوكول يوضح كيفية استخدام المجهر فائقة الدقة لدراسة البروتين التعريب المشترك في الثقافات العصبية الأولية.

التصوير فائق الدقة لدراسة التعريب المشترك للبروتينات وعلامات متشابك في الخلايا العصبية الأولية

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

نقاط الاشتباك العصبي هي العناصر الوظيفية للخلايا العصبية وعيوبها أو خسائرها هي في أساس العديد من الاضطرابات العصبية والعصبية. وتستخدم على نطاق واسع دراسات التصوير للتحقيق في وظيفتها واللدونية في الظروف الفسيولوجية والمرضية. بسبب حجمها وهيكلها، تتطلب دراسات توطين البروتينات تقنيات تصوير عالية الدقة.في هذا البروتوكول، نحن وصف إجراء لدراسة في الخلايا العصبية الأولية التعريب المشترك للبروتينات المستهدفة مع علامات متشابك على مستوى فائقة الدقة باستخدام المجهر الإضاءة منظم. SIM هي تقنية إضاءة ضوئية منقوشة تضاعف الدقة المكانية للمجهر العريض ، لتصل إلى تفاصيل حوالي 100 نانومتر. يشير البروتوكول إلى عناصر التحكم والإعدادات المطلوبة لإجراء دراسات قوية للترجمة المشتركة ونظرة عامة على الأساليب الإحصائية لتحليل بيانات التصوير بشكل صحيح.بيد أن مفتاح السماح بإجراء التحليل على مستوى فائق الاستبانة هو الكواشف المستخدمة أثناء الاقتناء، مثل الأغطية المغطّاة بحجرات وحلول التركيب المتوافقة مع مؤشر الحيود للهدف. للحصول على العصبون العصبية الأولية فرس النهر الماوس، عزل فرس النهر من P1 إلى P4 الجراء. خلايا الصفيحة في 70،000 الخلايا في بئر في حجم 200 ميكرولترات في البئر.الانتظار حتى يتم نضج الخلايا العصبية الأساسية فرس النهر تماما 12 إلى 14 يوما بعد الطلاء لإجراء دراسات التعريب المشترك. إضافة 4٪ paraformaldehyde، PFA، في برنامج تلفزيوني 200 ميكرولترس في بئر إلى الخلايا العصبية لإصلاحها بسرعة. إزالة الحل واحتضان العينات مع 1٪ من البوم المصل البقري، BSA، في برنامج تلفزيوني في 200 ميكرولترس في البئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتغطية بشكل سلبي جميع الأسطح المجانية الربط من لوحة مع بروتين غير ذي صلة للتحليل.يقلل حاجز الحجب القائم على BSA بدون Triton X-100 من خلفية الأجسام المضادة بكفاءة أكبر من نفس المخزن المؤقت مع 0.2٪ Triton X-100. إضافة الأجسام المضادة الأساسية. كتحكم سلبي، لا تضيف أي جسم مضاد أساسي إلى أحد الآبار.خلايا جبل باستخدام mountant SIM المتوافقة، على سبيل المثال ProLong زجاج Antifade Mountant. تغطية وحماية الخلايا مع غطاء زجاجي، على سبيل المثال، غلاف دائري مع قطر ثمانية ملليمترات.ويمكن أيضا أن تكون تلك المربعة المستخدمة. تخزين الأغطية الغرف في درجة حرارة الغرفة والانتظار على الأقل 48 ساعة قبل الحصول على الصور. يتطلب زجاج الألماس يومين على الأقل من العلاج قبل عمليات الاستحواذ فائقة الدقة.استخدم استراتيجيتين لضمان خصوصية الأجسام المضادة. الأول هو استخدام ما لا يقل عن اثنين من الأجسام المضادة المختلفة التي تستهدف نفس الركيزة. الاستراتيجية الثانية هي تحييد الأجسام المضادة عن طريق الحضانة مع الهدف البروتين المنقى، أو المستخدمة لرفع الأجسام المضادة.نحن نستخدم بشكل روتيني مجهر فائق الدقة من N-SIM الذي تصنعه نيكون لتحليلنا. الإرشادات التالية هي أن تكون مخصصة للحصول على صور SIM بشكل مستقل عن مجهر الاستخدام. من المهم أيضا لتحقيق أقصى قدر من أداء المجهر لإجراء معايرة دقيقة من الصكوك، بما في ذلك حلقة التصحيح، محاذاة الليزر، والتركيز كتلة صريف.قبل الحصول على صور SIM ، يتطلب النظام معايرة مناسبة مع حبات فلورية ذات حجم دون دقة محددة. ومن الأمثلة على ذلك مصغرة رباعية التفرعات. هذه الخرز ملطخة بأصباغ فلورية مختلفة للسماح بمعايرة أشعة الليزر المختلفة مع عينة واحدة.في حمام مائي، sonicate حوالي 1.8 مرات 10 إلى 8 الفلورسنت microspheres لمدة 10 دقائق. تمييع الفلورسنت microspheres واحد من كل 500 في الماء المقطر مزدوجة. سونيكات للمرة الثانية لمدة 10 دقائق إضافية.الماصات 15 ميكرولترات من الخرز المخفف في بئر من غطاء الحجرة. اسمحوا الحل الجاف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 10 ميكرولترات من حل تصاعد، على سبيل المثال.برولونغ زجاج، ووضع غطاء ثمانية ملليمتر على القمة. انتظر 48 ساعة على الأقل للسماح بالمعالجة المناسبة. بدوره على المجهر وأشعة الليزر.دع النظام يسخّن للوصول إلى التوازن الحراري لجميع مكونات المجهر ويتطلب نظام المجهر فائق الدقة SIM ثلاث ساعات على الأقل. حدد الهدف 100X. بدء المعايرة عن طريق محاذاة أشعة الليزر إلى مركز كتلة صرع الحيود.في نظام N-SIM، يسمح مقبض ميكرومتر وكاميرا مخصصة بتمركز الحزم الضوئية إلى الهدف. أدخل غطاء الأغطية المغطى بالحجرة من المجهر للعرض. تعيين النظام إلى سمك غطاء الغرف عن طريق ضبط غطاء التصحيح الموضوعي.NIS Software، وهو برنامج مملوك مزود بأنظمة مجهرية فائقة الدقة من نوع N-SIM، له وظيفة تلقائية لتنظيم تصحيح الألوان. ضبط تركيز كتلة الصريف لكل قناة لضمان تركيز الإضاءة نمط منظم على العينة. يوفر البرنامج وظيفة تلقائية لهذه المهمة.الحصول على صور SIM 3D الخام من microspheres متعددة الألوان. حساب لكل طول موجي منفصل تحويل فورييه للصورة فائقة الحل. إذا فشلت الصورة المحولة في الحصول على نمط مثل الزهور الصحيح، إعادة تشغيل المعايرة منذ لم يتم تحقيق فائقة الدقة.في الصورة فائقة الحل، حدد ميكروسير واحد وحساب ملفه الشخصي كثافة لكل قناة لقياس دقة التي تحققت. وينبغي أن يكون الآن على مقربة من 100 نانومتر في وقت لاحق. تنفيذ تسجيل القناة عن طريق تراكب اقتناء متعدد القنوات من microspheres.والهدف هو أن collimate جميع إشارات القناة بشكلٍ مُشَرَق وبديهي. هذا سوف القضاء على الانحرافات لوني بسبب عدم محاذاة القنوات المختلفة ويساعد على تحليل التعريب المشترك. تأكيد جودة المعايرة باستخدام وظائف مرحلة الإضاءة خطوة والإضاءة نمط التركيز من SIMcheck، مجموعة من الإضافات لتطبيق المصدر المفتوح ImageJ.ابدأ في تحليل العينة باستخدام هدف 40X في وضع confocal أو widefield. هذا يسمح الملاحة من العينة، والحفاظ على التفاصيل الجيدة ومجال كبير من الرؤية. استخدم إشارة الأجسام المضادة MAP2 للكشف عن منطقة تمثل العمليات العصبية.الحصول على صور للعينة في وضع confocal لتحديد نوعية تلطيخ. التحول إلى الهدف 100X. تطبيق النفط على الهدف 100X.الحصول على صورة واسعة أو confocal التي سيتم استخدامها في وقت لاحق لتقييم جودة الصورة فائقة حل. التبديل إلى وضع SIM ثلاثي الأبعاد. باستخدام إطارات الحوار لتعيين معلمات الحصول على، حدد أعلى إعداد عمق بت المتوفرة لزيادة معلومات اللون إلى أقصى حد.عادةً، 16 بت هو الخيار القياسي. وعلاوة على ذلك، لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، حدد قيمة التردد المنخفض للاستحواذ، مثل ميغاهرتز واحد. باستخدام النوافذ المدرج التكراري، تعيين قوة الليزر للحصول على استجابة خطية من إشارة لتجنب فقدان المعلومات، والحد من بكسل المشبعة في الصور.يستخدم نظام N-SIM كاميرا أندور iXon3. عند العمل عند 16 بت، اختر شدة الهدف من 16،000 لضمان استجابة خطية للكاميرا. وبدلاً من ذلك، اختر نطاقًا يتراوح بين 30،000 إلى 45،000 لتعظيم النطاق الديناميكي لعمليات الاستحواذ.تعيين قوة الليزر بين 0.1٪ و 50٪ عند تصوير العينات وأوقات التعرض بين 50 مللي ثانية وثانيتين. قد القوى الليزر فوق 50٪ يسبب photobleaching سريع من الفلوروفوريس في الاستخدام. ابدأ في الحصول على الصور في وضع SIM ثلاثي الأبعاد.استخدم SIMcheck ، وهو عبارة عن مجموعة من الإضافات المجانية لـ ImageJ ، لتقييم جودة عمليات الاستحواذ على الصور الخام. إذا لم يكشف SIMcheck عن أي آثار أو مشكلات تتعلق بالجودة، احصل على 10 صور على الأقل من النسخ المتماثلة التقنية الكاملة للسماح بإجراء تحليل إحصائي. الصور المكتسبة هي بيانات أولية تحتاج إلى معالجة للحصول على صور SIM المعاد بناؤها التي سيتم استخدامها لمزيد من التحليل.في البروتوكول، نقترح استخدام synaptophysin و PSD-95 كعلامات ما قبل وما بعد متشابك. ومع ذلك، يمكن استخدام علامات إضافية. وهناك مجموعة ضخمة من الأدب يدعم استخدام البروتينات الأخرى، مثل drebrin وباسون كعلامات متشابك.صور 3D SIM المكتسبة هي الصور الخام التي تحتاج إلى معالجة للحصول على إعادة بناء فائقة حل الصور. إعادة بناء غير صحيحة من الصور الخام يمكن أن يؤدي إلى القطع الأثرية التي من شأنها أن تؤثر على تحليل العينات. ولذلك ينبغي إيلاء اهتمام كبير لاختيار معايير إعادة الإعمار على النحو الصحيح.معالجة الصور الخام باستخدام برنامج تحليل إعادة بناء المجهر للحصول على صورة فائقة الحل. بدلا من ذلك ، استخدم البرنامج المساعد ImageJ المتاحة مجانا fairSIM لإعادة بناء الصور الخام. حساب فورييه تحويل الصور فائقة حل باستخدام برنامج إعادة بناء المجهر أو ImageJ البرنامج المساعد SIMcheck.يجب أن تعود صورة جيدة أعيد بناؤها ، لكل قناة ، صورة تشبه الزهرة. إذا فشلت الصور المعاد بناؤها في إعادة إنشاء شكل يشبه الزهرة، قم بإعادة التشغيل من الصور الخام وإعادة بنائها عن طريق تعديل معلمات إعادة البناء، مثل التصفية الخطية، والبوديبل، وإلغاء ترتيب الصفر. في NIS Software باستخدام المعاينة لمراقبة كيفية تأثير تغيير المعلمات على الصورة النهائية التي تم حلها، قم بتعديل تباين تعديل الإضاءة الخاص بالمعلمة، ومنع الضوضاء عالية الدقة، والخروج من التركيز.تحليل الصورة المعاد بناؤها للكشف عن القطع الأثرية بشكل غير متحيز باستخدام NanoJ-SQUIRREL ، وهو مكون إضافي يستند إلى ImageJ ، لتقييم جودة الصور فائقة الحل. في تحليلنا للتوطين المشترك، استخدمنا نهجين. الأول هو نهج مرئي يستند إلى تحليل الملف الشخصي الذي يظهر أحداث فردية للتعريب المشترك ويحدد مساهمة كل قناة.كخطوة أولى لدراسة التعريب المشترك بين علامات متشابكة والبروتين من الفائدة، واتخاذ صورة فائقة حل وتحليل مكان واحد لتحديد تداخل إشارة. تحديد موضع واحد على الصورة فائقة الحل. الحصول على ملامح كثافة الإشارات الفلورية إلى موضع الاهتمام.إذا كان تحليل الملف الشخصي قد اقترح توطينًا مشتركًا في الملوس الواحد ، فيمكن إجراء تحليل أكثر عمومية للصورة بأكملها عن طريق حساب معاملات Pearson و Mander. استخدم JACoP ، وهو مكون إضافي لـ ImageJ ، لتحديد معلمتين للتعريب المشترك ، بيرسون وماندر. بعد معايرة النظام وتقييم جودة الصور المعاد بناؤها ، بدأنا بعد ذلك في تحليل الثقافات العصبية الأولية الملطخة باجسام مضادة ضد MAP2 ، علامة عصبية ، PSD-95 ، علامة ما بعد الطمث ، وهدفنا بروتين SUMO1.قمنا أولا بتحليل العينة التي تقوم بإجراء المجهر confocal أربع قنوات مع هدف 40X. عند اختيار منطقة تمثل العمليات العصبية، انتقلنا إلى هدف 100X. لقد حصلنا على صور confocal و SIM لنفس المنطقة لتقييم جودة إعادة الإعمار مع NanoJ-SQUIRREL وإجراء تحليل التعريب المشترك.إن توضيح بنية وتكوين المشبك أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات الفسيولوجية والمرضية على حد سواء التي تنظم الذاكرة والإدراك. بينما في حالة العادية نقاط الاشتباك العصبي هي اللبنات الأساسية للذاكرة، كما أنها هي في أساس الاضطرابات العصبية المعقدة، مثل واحدة من الأشكال الأكثر شيوعا من مرض الزهايمر الخرف. البروتوكول الموصوف هنا يسمح بدراسة تكوين البروتين من نقاط الاشتباك العصبي مع تقنية المجهر فائقة الدقة تسمى المجهر الإضاءة المنظم.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

القبض على الليزر Microdissection ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية المحيطية

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation من الخلايا العصبية من الدماغ القوارض شرائح لدراسة نقل صورة متشابك ومحطات قبل المشبكي

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

فائقة الدقة التصوير من الخلايا العصبية الحويصلات كثيفة الأساسية

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

التصوير في الوقت الحقيقي من محور عصبي نقل الكم دوت المسمى عامل التغذية العصبية في الخلايا العصبية الابتدائية

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

مقايسة ضوئية لإعادة التدوير حويصلة متشابك في الخلايا العصبية مثقف Overexpressing البروتينات Presynaptic

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...